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目的:通过前期甲基化芯片450K Infinium Methylation BeadChip检测得到的差异表达甲基化位点,筛选出高甲基化基因LAMA3,分析其位点甲基化频率与临床病理因素之间的关系,同时利用焦磷酸测序方法验证LAMA3基因在卵巢上皮癌耐药和敏感组织中的甲基化水平。前期研究发现卵巢上皮癌耐药组织中LAMA3高甲基化低表达,现探讨过表达LAMA3基因对卵巢上皮癌细胞的铂类化疗敏感性及其对卵巢上皮癌细胞生物学功能的影响。方法:提取38例耐药组及33例敏感组卵巢上皮癌组织DNA,将其进行重亚硫酸盐转化,经转化后的DNA进行PCR扩增获得PCR产物。以PCR产物作为模板,加入四种脱氧核苷酸行焦磷酸测序。统计测序结果,分析耐药组和敏感组的甲基化水平与芯片数据对比。LAMA3基因的chr18:21452788和chr18:21452819位点甲基化频率与临床病理因素进行Spearman相关分析。采用Synergistic Activation Mediator(SAM)双载体慢病毒成功构建稳定上调表达LAMA3的卵巢上皮癌细胞模型,利用Real Time Cell Analyzer(RTCA)法研究顺铂对卵巢癌细胞SKOV3/DDPⅡ-LAMA3的增殖抑制作用,SKOV3/DDPⅡ-LAMA3细胞的生长曲线,迁移侵袭能力和黏附能力。流式细胞术检测顺铂对SKOV3/DDPⅡ-LAMA3细胞凋亡的影响。结果:LAMA3基因的chr18:21452788位点和chr18:21452819位点在耐药组中的平均甲基化频率均高于敏感组。相对于敏感组织,LAMA3基因在耐药组织的表达下调2.58倍。chr18:21452788的甲基化频率与患者年龄、细胞分化程度、FIGO分期和病理类型无明显相关(P>0.05)。chr18:21452819的甲基化频率与患者年龄、细胞分化程度和病理类型无明显相关(P>0.05),而与FIGO分期呈正相关(P<0.05)。chr18:21452788的甲基化频率对卵巢上皮癌患者PFS的影响无统计学意义(P>0.05),对患者OS的影响有统计学意义(P<0.05)。chr18:21452819的甲基化频率对卵巢上皮癌患者PFS的影响有统计学意义(P<0.05),对患者OS的影响无统计学意义(P>0.05)。6-10 h时间内,40μM和80μM浓度的顺铂促进SKOV3/DDPⅡ、SKOV3/DDPⅡ-LAMA3-NC和SKOV3/DDPⅡ-LAMA3增殖,10 h后三种细胞数量急剧下降。0-45 h内,三种细胞生长基本一致,从45 h开始,SKOV3/DDPⅡ-LAMA3生长速度明显快于SKOV3/DDPⅡ。80 h后,三种细胞生长速度明显加快,但SKOV3/DDPⅡ-LAMA3低于其他两种细胞。迁移实验的前6 h,SKOV3/DDPⅡ-LAMA3的CI值明显高于SKOV3/DDPⅡ。细胞侵袭过程中SKOV3/DDPⅡ-LAMA3细胞的CI值始终高于SKOV3/DDPⅡ细胞和SKOV3/DDPⅡ-LAMA3-NC细胞。在FN蛋白浓度为15-25μg/ml范围内,SKOV3/DDPⅡ-LAMA3细胞在0.6 h处黏附速度明显减缓,其他两种细胞黏附速度逐渐减缓并在2 h左右到达平台期。结论:LAMA3基因在卵巢上皮癌耐药组织中呈高甲基化低表达状态,可能是具有预测卵巢上皮癌化疗敏感性及预后作用的基因。低浓度顺铂对SKOV3/DDPⅡ、SKOV3/DDPⅡ-LAMA3-NC和SKOV3/DDPⅡ-LAMA3三种细胞表现出促增殖作用,其中对SKOV3/DDPⅡ-LAMA3促增殖作用最为明显,高浓度顺铂则是先促进细胞增殖后抑制细胞增殖。0-6 h时间内,SKOV3/DDPⅡ-LAMA3迁移能力强于SKOV3/DDPⅡ。过表达LAMA3的SKOV3/DDPⅡ细胞侵袭能力比亲本细胞强。同种细胞随FN浓度增大黏附能力增强,FN浓度较大时,SKOV3/DDPⅡ-LAMA3黏附能力最弱。