【摘 要】
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目的探究Brn4调节小鼠海马神经干细胞（neural stem cells,NSCs）增殖与分化的作用机制。方法1.从新生ICR小鼠海马组织中获取NSCs进行体外培养;2.Brn4过表达慢病毒感染NSCs,并采用RNA-seq及Ch IP-seq两种测序方法检测Brn4过表达后细胞内基因表达水平的变化。选取两种测序结果的交集,并采用RT-q PCR、染色质免疫共沉淀、双荧光素酶报告基因实验及Wes
【基金项目】
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国家自然科学基金（31171038）:Brn-4促进神经干细胞向神经元分化的分子机制
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目的探究Brn4调节小鼠海马神经干细胞（neural stem cells,NSCs）增殖与分化的作用机制。方法1.从新生ICR小鼠海马组织中获取NSCs进行体外培养;2.Brn4过表达慢病毒感染NSCs,并采用RNA-seq及Ch IP-seq两种测序方法检测Brn4过表达后细胞内基因表达水平的变化。选取两种测序结果的交集,并采用RT-q PCR、染色质免疫共沉淀、双荧光素酶报告基因实验及Western blot验证Brn4结合的下游靶基因;3.根据靶基因的核苷酸序列长短,构建靶基因过表达慢病毒或CRISPR SAM协同激活质粒,同时构建靶基因sh RNA干扰慢病毒,并验证基因过表达或敲低效率;4.采用Ed U细胞增殖实验、流式细胞术细胞周期分析及CCK-8实验检测靶基因过表达或敲低后NSCs的增殖能力;5.采用免疫荧光染色、RT-q PCR及Western blot实验检测靶基因过表达或敲低后NSCs经含1%FBS的DMEM/F-12诱导分化为神经元的能力;6.挽救实验:Brn4 sh RNA干扰慢病毒感染NSCs后,过表达靶基因并采用上述方法检测NSCs增殖与分化的能力。结果1.RNA-seq及Ch IP-seq测序结果交集共16个基因,经RT-q PCR、染色质免疫共沉淀、双荧光素酶报告基因实验及Western blot最终确定两个靶基因,即Lama2与Samsn1;2.Ed U细胞增殖实验、流式细胞术细胞周期分析及CCK-8实验表明,NSCs增殖能力在过表达Lama2或Samsn1后下降,在敲低Lama2或Samsn1后升高。挽救实验也显示,过表达Lama2和Samsn1可部分挽救Brn4敲低对NSCs增殖能力的影响;3.免疫荧光染色、RT-q PCR及Western blot实验表明,过表达Lama2或Samsn1后,Tuj1阳性细胞数量增多,MAP2及Tuj1表达量升高,S100b及GFAP表达量降低。敲低Lama2或Samsn1后,实验结果相反。挽救实验也显示,过表达Lama2和Samsn1可部分挽救Brn4敲低对NSCs向神经元分化能力的影响。结论1.Brn4结合在Lama2和Samsn1的启动子上,并促进其表达;2.Lama2和Samsn1可抑制小鼠海马NSCs增殖;3.Lama2和Samsn1部分介导了Brn4抑制海马NSCs增殖的作用;4.Lama2和Samsn1可促进小鼠海马NSCs向神经元分化;5.Lama2和Samsn1部分介导了Brn4促进海马NSCs向神经元分化的作用。
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