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全身麻醉可致幼年小鼠发育期大脑Tau蛋白异常磷酸化和远期认知功能障碍,但其具体机制尚未阐明。研究指出,载脂蛋白E(Apolipoprotein E,Apo E)可能在阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)患者的神经元活动和损伤修复中起保护作用,而其毒性片段可引起AD患者的神经退行性变和神经认知功能损害。本文拟在既往研究基础上,探讨Apo E及其毒性片段在多次七氟烷麻醉所致幼年小鼠海马Tau蛋白磷酸化和神经认知功能的差异中的作用。本实验分别对野生型(WT)、Apo E基因敲除型(Apo E-KO)、Apo E3靶向替代型(Apo E3,同时表达全长Apo E及Apo E片段)和Apo E2靶向替代型(Apo E2,只表达全长Apo E)小鼠进行多次七氟烷麻醉;此外,上述不同基因表型的神经元也被用于研究。结果表明,与对照组相比,多次七氟烷麻醉可使幼年小鼠Apo E m RNA、总Apo E、全长Apo E、Apo E片段和磷酸化Tau蛋白(AT8和PHF1)表达上调,同时引起远期认知功能障碍,但对成年小鼠无明显影响。与对照组相比,七氟烷刺激可引起WT及Apo E-KO小鼠及幼稚神经元磷酸化Tau蛋白表达明显增加,并且,七氟烷多次麻醉可同时造成WT及Apo E-KO小鼠远期认知功能障碍。与对照组相比,七氟烷刺激可使Apo E3型小鼠及幼稚神经元中磷酸化Tau蛋白表达明显增加,而Apo E2型小鼠及神经元中磷酸化Tau蛋白表达并未明显增加。且七氟烷多次麻醉只造成Apo E3小鼠远期认知功能障碍,而对Apo E2小鼠不产生认知功能损伤。这些数据表明,Apo E片段水平的上调,而非全长Apo E的增加,是多次七氟烷麻醉所致幼年小鼠年龄依赖性Tau蛋白磷酸化增加和神经认知损伤的潜在机制之一。实验一:载脂蛋白E在七氟烷多次麻醉致发育期大脑损伤中的作用目的:本部分实验拟探讨七氟烷多次麻醉对幼年(P6)小鼠及成年(P60)小鼠海马Apo E表达水平和远期认知功能的改变。方法:将出生后6d(P6)小鼠及出生后60d(P60)小鼠随机分为4组:幼年对照组(P6+Control),幼年七氟烷组(P6+Sevoflurane),成年对照组(P60+Control),成年七氟烷组(P60+Sevoflurane)。七氟烷组小鼠进行3%七氟烷+60%氧气,每天2小时,连续3天的麻醉处理。对照组小鼠则置于相同环境,只给予60%氧气处理。麻醉结束后,每组随机挑选10只小鼠,置于标准化饲养环境,分别饲养至出生后30d(P30)及出生后84d(P84),利用莫氏水迷宫实验(Morris Water Maze Test,MWM test)测试各组小鼠远期认知功能;每组选择3只小鼠制备大脑横断面切片,应用免疫荧光法(Immunofluorescence)检测海马中Tau-PS202/PT205(AT8)及Apo E表达;余下小鼠提取海马组织,以备蛋白免疫印迹实验(Western Blot)、酶联免疫吸附实验(ELISA)检测各组小鼠海马Total Tau(Tau5)、Tau-PS202/PT205(AT8)、Tau-PSer396/404(PHF1)、完整长度载脂蛋白E(Full-length Apo E)和载脂蛋白E片段(Apo E fragments)的表达水平,实时定量逆转录(RT-PCR)实验检测Apo E m RNA转录水平。结果:1.七氟烷多次麻醉会增加幼年小鼠海马Total Apo E、Full-length Apo E和Apo E fragments的表达(均P<0.05),而对成年小鼠无影响(P>0.05);2.七氟烷多次麻醉会导致幼年小鼠海马AT8和PHF1表达上调(均P<0.05),而对成年小鼠无影响(P>0.05);3.七氟烷多次麻醉会造成幼年小鼠远期认知功能障碍(P<0.05),而对成年小鼠无影响(P>0.05)。结论:七氟烷多次麻醉会导致幼年小鼠海马磷酸化Tau蛋白水平升高,并造成远期认知功能障碍,其机制或与海马Apo E表达上调有关。实验二:总Apo E表达增高与七氟烷致发育期大脑损伤的关系目的:探讨多次七氟烷麻醉对发育期脑损伤是否与海马Total Apo E水平上调有关。方法:(1)细胞实验:将从野生型及Apo E-KO胎鼠海马中提取的原代神经元培养至第5天,随机分为野生型对照组(WT+Control),野生型七氟烷组(WT+Sevoflurane),敲除型对照组(Apo E-KO+Control),敲除型七氟烷组(Apo E-KO+Sevoflurane)。七氟烷组神经元于培养第5天时,给予60%氧气+5%二氧化碳+4.1%七氟烷连续处理4小时,而对照组神经元则置入相同环境只给予60%氧气+5%二氧化碳处理4小时。造模结束后,收集神经元进行Western Blot、IF检测各组Tau5、AT8、PHF1、Apo E水平,采用RT-PCR实验测定各组神经元Apo E m RNA转录水平。(2)动物实验:将P6野生型雌鼠及Apo E-KO型雌鼠随机分为4组:野生型对照组(WT+Control),野生型七氟烷组(WT+Sevoflurane),敲除型对照组(Apo E-KO+Control),敲除型七氟烷组(Apo E-KO+Sevoflurane)。七氟烷组小鼠进行3%七氟烷+60%氧气,每天2小时,连续3天的麻醉处理。对照组小鼠则置于相同环境只给予60%氧气处理。麻醉结束后,每组随机挑选10只小鼠,置于标准化饲养环境,饲养至P30,利用MWM Test检测各组小鼠远期认知功能;每组选择3只小鼠制备大脑横断面切片,采用免疫荧光法检测海马中Tau-PS202/PT205(AT8)及Apo E表达;提取余下小鼠海马组织,以备WB、ELISA、IF检测各组小鼠海马Tau5、AT8、PHF1、Total Apo E、Full-length Apo E和Apo E fragments的表达水平,RT-PCR检测各组小鼠海马Apo E m RNA转录水平。结果:(1)细胞实验:(1)WT+Control组神经元表达极少量的Apo E m RNA、Total Apo E和Full-length Apo E,且几乎不产生任何Apo E片段;而七氟烷麻醉处理显著提高了WT+Sevoflurane组神经元Apo E m RNA、Total Apo E、Full-length Apo E和Apo E fragments水平(均P<0.05)。(2)蛋白免疫印迹实验提示,Apo E-KO+Control组神经元的AT8和PHF1水平较WT+Control组显著升高(均P<0.05)。七氟烷多次麻醉在WT神经元中导致的AT8和PHF1水平上调(均P<0.05)在Apo E-KO神经元中未被改善(均P>0.05)。(3)免疫荧光结果提示,在WT神经元中,七氟烷处理会使Apo E及AT8阳性细胞数显著高于对照组(均P<0.05)。(2)动物实验:(1)在WT小鼠中,与对照组相比,七氟烷组Apo E m RNA及总Apo E蛋白水平均显著升高(均P<0.05)。(2)WB结果提示,在WT型小鼠中,与对照组相比,七氟烷组小鼠全长Apo E和Apo E片段表达水平显著上调(均P<0.05)。(3)此外,在对照组中,Apo E-KO型幼鼠海马AT8和PHF1表达水平显著高于WT型幼鼠(均P<0.05),七氟烷多次麻醉不能诱导Apo E-KO型幼鼠海马AT8和PHF1表达上调(均P>0.05)。(4)与对照组相比,七氟烷多次麻醉可对WT型幼鼠造成认知损伤(P<0.05),而在Apo E-KO小鼠中无显著差异(P>0.05);即使在对照组中,Apo E-KO小鼠或比WT小鼠表现得更为“愚蠢”(P<0.05)。结论:七氟烷多次麻醉可使总Apo E表达增加,但是Apo E缺乏可导致幼稚神经元和发育期海马Tau蛋白磷酸化上调,抑制总Apo E的表达不能改善七氟烷多次麻醉诱导的Tau蛋白异常磷酸化和远期认知功能损伤。实验三:Apo E片段表达增高与七氟烷致发育期大脑损伤的关系目的:探讨载脂蛋白E毒性片段与七氟烷多次麻醉致发育期大脑Tau蛋白异常磷酸化及远期认知功能障碍的关系。方法:(1)细胞实验:将从Apo E3型及Apo E2型胎鼠海马中提取的原代神经元培养至第5天,随机分为Apo E3对照组(Apo E3+Control),Apo E3七氟烷组(Apo E3+Sevoflurane),Apo E2对照组(Apo E2+Control),Apo E2七氟烷组(Apo E2+Sevoflurane)。七氟烷组神经元于培养第5天时,给予60%氧气+5%二氧化碳+4.1%七氟烷连续处理4小时,而对照组神经元则置于相同环境只给予60%氧气+5%二氧化碳处理4小时。造模结束后,收集神经元进行WB、IF检测Tau5、AT8、PHF1和Apo E水平,采用RT-PCR实验测定各组神经元Apo E m RNA转录水平。(2)动物实验:将P6 Apo E3型雌鼠和P6 Apo E2型雌鼠随机分为4组:Apo E3对照组(Apo E3+Control),Apo E3七氟烷组(Apo E3+Sevoflurane),Apo E2对照组(Apo E2+Control),Apo E2七氟烷组(Apo E2+Sevoflurane)。七氟烷组小鼠进行3%七氟烷+60%氧气,每天4小时,连续3天的麻醉处理。对照组小鼠则置于相同环境只给予60%氧气处理。麻醉结束后,每组随机挑选10只小鼠,置于标准化饲养环境,饲养至P30,利用MWM test测试各组小鼠远期认知功能;每组选择3只小鼠制备大脑横断面切片,应用免疫荧光法(Immunofluorescence)检测海马中Tau-PS202/PT205(AT8)及Apo E表达;提取余下小鼠海马组织,以备WB、ELISA、IF检测各组小鼠海马Tau5、AT8、PHF1、总Apo E、全长Apo E和Apo E片段的表达水平,RT-PCR实验检测各组小鼠海马Apo E m RNA转录水平。结果:(1)细胞实验:(1)七氟烷麻醉使Apo E3和Apo E2神经元的Apo E m RNA、Total Apo E、Full-length Apo E水平较对照组均显著升高(均P<0.05)。此外,与Apo E3+Control组神经元相比,Apo E3+Sevoflurane组神经元中Apo E片段水平显著升高(P<0.05),但在Apo E2型神经元中,Control组和Sevoflurane组均几乎未见Apo E片段表达。(2)七氟烷处理后,Apo E3神经元AT8和PHF1表达水平均高于对照组(均P<0.05),而在Apo E2神经元中无显著变化(均P>0.05)。(2)动物实验:(1)七氟烷多次麻醉可提高Apo E3和Apo E2靶向替代小鼠Apo E m RNA和总Apo E蛋白水平(均P<0.05)。WB结果显示,在Apo E3型幼鼠中,与对照组相比,七氟烷组全长Apo E和Apo E片段表达水平均显著升高(均P<0.05),而在Apo E2小鼠中无显著差异(均P>0.05)。此外,Apo E2型对照组和七氟烷组幼鼠海马Apo E片段水平均可忽略不计。(2)七氟烷麻醉不能使Apo E2小鼠的AT8和PHF1水平升高(均P>0.05),而在Apo E3小鼠中,七氟烷组的AT8和PHF1表达均高于对照组(均P<0.05)。(3)七氟烷麻醉只会造成Apo E3靶向替代小鼠,而非Apo E2靶向替代小鼠的远期认知功能损伤。结论:Apo E的毒性片段(而非全长Apo E)是七氟烷多次麻醉致发育期大脑Tau蛋白异常磷酸化和远期认知功能障碍的主要原因。全文总结论:正常脑组织中可能存在一个全长Apo E和Apo E片段间的平衡,其中全长Apo E扮演者重要的保护角色,而片段型Apo E具有神经毒性。在正常情况下,大脑中Apo E主要由星形胶质细胞产生,在神经元中少量表达,且大部分为全长Apo E,很少有Apo E毒性片段。当大脑面对有害刺激的存在时,神经元会被激活大量全长Apo E进行修复自身。然而,一旦有害的刺激持续存在,神经元中的Apo E则会水解成大量的毒性片段并破坏大脑内的Apo E平衡,这可能导致神经毒性和神经退行性变,并致脑内的Tau蛋白过度磷酸化和神经认知损伤。总之,多次七氟烷麻醉后,载脂蛋白E片段(而非全长载脂蛋白E)水平的上调可能是年龄依赖性Tau蛋白磷酸化和神经认知功能障碍的潜在机制之一。这些发现为临床上预防和治疗儿童术后神经认知障碍提供了潜在的靶点。