论文部分内容阅读
山羊副流感病毒3型（Caprine parainfluenza virus type 3,CPIV3）属于副粘病毒科（Paramyxoviridea family）、副粘病毒亚科（Paramyxovirinea family）、呼吸道病毒属（Respirvirus genus）,具有囊膜的单股负链RNA病毒,同属成员还包括人副流感病毒3型（Human parainfluenza virus type 3,HPIV3）、人副流感病毒1型（Human parainfluenza virus type 1,HPIV1）、牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3）和仙台病毒（Sendai virus,Se V）。目前国内外对HPIV3、HPIV1、BPIV3和Se V的研究较为成熟,但由于CPIV3是新发现的病毒,对于CPIV3的研究尚停留在起步阶段,缺乏对CPIV3复制、感染、致病机制和免疫应答的深入研究。因此,研究CPIV3致病机制和宿主细胞抗病毒免疫应答有着重要意义。固有免疫是机体抵抗病原体入侵的第一道屏障,而干扰素（Interferons,IFN）介导的抗病毒作用是其中极为重要的环节。干扰素刺激基因（Interferon stimulated genes,ISGs）作为由IFN诱导表达的基因,在宿主抵抗病毒感染的过程中扮演着十分重要的角色。在前期研究中发现,将CPIV3 JSHA-2014-1接种MDBK细胞,干扰素（IFN-α、INF-β）及其通路上游基因My D88、MAVS、MDA5、IRF2、IRF3、IRF7、IRF9 m RNA转录量表达无显著差异,而干扰素通路下游的ISGs:IFI6、ISG15、OAS1Y、OAS1Z、Mx1、Mx2和RSAD2 m RNA转录量都有不同程度上调,提示宿主细胞通过产生抗病毒因子来影响CPIV3增殖。本研究建立了IFI6、ISG15、OAS1Y、OAS1Z、Mx1、Mx2和RSAD2基因SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,探究CPIV3感染的MDBK细胞中7种ISGs转录上调水平;并构建IFI6、ISG15、OAS1Y、OAS1Z、Mx1、Mx2和RSAD2基因过表达载体,研究7种ISGs对CPIV3复制的影响,以期为CPIV3致病机制的阐明和抗病毒药物的研发奠定基础。主要研究内容包括:1、7种ISGs m RNA SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的建立与应用为探究CPIV3感染MDBK细胞后的抗病毒免疫应答,本研究针对7种ISGs:IFI6、ISG15、OAS1Y、OAS1Z、Mx1、Mx2和RSAD2的基因序列设计特异性引物,经优化建立了SYBR Green I荧光定量PCR方法。用所建立的方法检测CPIV3 JS2013株感染MDBK细胞24 h、48 h和72 h后7种ISGs m RNA转录水平变化。结果显示,在72 h内,随着感染时间越长,7种ISGs的转录量上调倍数越大,其中ISG15、Mx1、Mx2和RSAD2的转录上调量持续高于IFI6、OAS1Y和OAS1Z。结果表明,CPIV3 JS2013株可刺激MDBK细胞中这7种ISGs的大量转录,为进一步研究其抗病毒功能提供了理论依据。2、7种ISGs过表达载体的构建与表达鉴定为研究IFI6、ISG15、OAS1Y、OAS1Z、Mx1、Mx2和RSAD2基因过表达载体在MDBK细胞中的表达情况。本研究构建了7种ISGs过表达载体,并通过RT-q PCR、IFA和Western blot检测其在MDBK细胞中的表达。结果显示,成功构建了7种重组质粒:p EGFP-N1-Flag-IFI6、p EGFP-N1-Flag-ISG15、p EGFP-N1-Flag-OAS1Y、p EGFP-N1-Flag-OAS1Z、p EGFP-N1-Flag-Mx1、p EGFP-N1-Flag-Mx2和p EGFP-N1-Flag-RSAD2。RT-q PCR结果显示,与对照组相比,转染的重组质粒组中7种ISGs的转录水平显著上调。IFA试验表明,与对照组细胞相比,转染的7种重组质粒组细胞中有明显的绿色荧光信号,且对照组中未见任何荧光信号,说明7种重组质粒在MDBK细胞中成功表达。与此同时,Western blot试验检测到7种重组蛋白:Flag-IFI6、Flag-ISG15、Flag-OAS1Y、Flag-OAS1Z、Flag-Mx1、Flag-Mx2和Flag-RSAD2融合表达,为后续研究这些ISGs对CPIV3的抗病毒作用研究提供了理论支撑。3、7种ISGs对CPIV3复制的影响为了研究IFI6、ISG15、OAS1Y、OAS1Z、Mx1、Mx2和RSAD2对CPIV3复制的影响,本研究通过将7种重组质粒转染MDBK细胞,待转染24 h后接种CPIV3 JS2013株病毒液,并于24 h和48 h后收获细胞培养液,通过RT-q PCR、病毒增殖滴度检测CPIV3在MDBK细胞中的增殖情况。RT-q PCR结果显示,与对照组相比,7种ISGs基因过表达的细胞中CPIV3 RNA含量显著下调;TCID50结果表明,转染重组质粒组中的病毒上清滴度均低于转染空质粒组和对照组中的病毒上清滴度。说明7种ISGs对CPIV3具有抑制作用。针对7种ISGs的基因序列,通过软件设计合成7种si-RNAs:si-IFI6、si-ISG15、si-OAS1Y、si-OAS1Z、si-Mx1、si-Mx2和si-RSAD2,将这7种si-RNAs分别转染MDBK细胞,24 h后接种CPIV3 JS2013株病毒液,并于24 h和48 h后收获细胞培养液。RT-q PCR结果显示,与对照组相比,7种si-RNAs转染组中CPIV3 RNA含量显著上调;TCID50结果表明,与对照组相比,7种si-RNAs转染组中病毒上清滴度均显著升高。进一步验证了7种ISGs对CPIV3的抑制作用,为抗CPIV3药物研发提供新的方法和药物靶标。