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研究背景及目的前列腺癌是男性泌尿生殖系统常见恶性肿瘤,近年来发病率迅速增加。雄激素阻断疗法是前列腺癌各个阶段最主要的治疗手段之一。但是,多数前列腺癌在平均12～18个月后逐渐对雄激素阻断疗法失去反应,转变为雄激素非依赖性前列腺癌,预后差。前列腺凋亡反应基因-4（prostate apoptosis response-4gene,par-4）是近来发现的一个促凋亡基因,其核心区凋亡肽（SAC）不需考虑癌细胞是否存在对Par-4敏感或抵抗,对激素依赖性和非激素依赖性前列腺癌细胞都能产生凋亡诱导效应。我们构建了SAC表达载体,同时引入了信号肽神经营养因子-4（neurotrohphin-4,NT4）及穿膜肽TAT,并进一步构建分泌NT4-SAC-HA2-TAT融合肽的重组腺伴随病毒,为探讨Par-4核心结构域SAC作为目的基因对前列腺癌的治疗作用奠定了基础。方法1.设计合成SAC的正向和反向引物,应用互为引物模板法合成具有NaeⅠ和KpnⅠ酶识别位点的SAC cDNA片段。将该片段克隆到pGEM-T easy中,转化细菌筛选阳性克隆,酶切鉴定,序列测定分析。2.NaeⅠ和KpnⅠ酶切pGEM-T-SAC,将所得SAC和已有HA2-TAT片段克隆到具有相应酶切位点的pBV220/NT4质粒,得到pBV220-NT4-SAC-HA2-TAT重组质粒。PCR扩增以EcoRⅠ、HindⅢ酶切上述质粒获取的NT4-SAC-HA2-TATcDNA片段,并将其克隆到pGEM-T easy中,转化细菌筛选阳性克隆,酶切鉴定,序列测定分析。3.将NT4-SAC-HA2-TAT融合基因片段插入具有相应酶切位点的pSSCMV病毒载体质粒,得到重组腺伴随病毒载体质粒。4.将已构建的重组腺伴随病毒载体质粒、腺病毒辅助质粒PFG140和包装质粒pAAV/Ad三质粒磷酸钙共沉淀法转染293细胞系,通过同源重组获得NT4-SAC-HA2-TAT重组腺伴随病毒载体,收集病毒,斑点杂交（Dot blot）法测定病毒滴度。结果1.SAC基因经DNA测序与Genebank序列一致。2.NT4-SAC-HA2-TAT融合基因经琼脂糖凝胶电泳鉴定正确。3.酶切鉴定证实已将NT4-SAC-HA2-TAT融合基因成功转至PSSCMV载体中;斑点杂交测定重组腺伴随病毒的滴度约为3.42×1010 PFU/ml～3.42×1011PFU/ml。结论1.成功克隆Par-4核心结构域SAC基因。2.成功构建具有穿膜功能的“NT4-SAC-HA2-TA”融合基因。3.成功构建PSSCMV/NT4-SAC-HA2-TA重组腺伴随病毒载体,并成功包装较高浓度的重组病毒。