【摘 要】
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真菌在现代工农业生产中被广泛应用,具有重要的经济价值。但是真菌菌株在培养过程中通常会发生退化,而不可逆的、可遗传的菌株退化常常造成巨大的商业损失。丝状真菌退化菌株的形态和生化异常现象已有广泛的记载,但是触发退化的遗传机制仍未可知。绿僵菌不但可以感染昆虫,还能与植物形成互惠共生的关系,已被开发成了真菌杀虫剂和生物肥料,广泛用于防治农林业害虫、卫生害虫以及它们所传播的疾病。在前期工作中,在绿僵菌的模式
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（NO.31872021）; 国家自然科学基金面上项目（NO.32172470）
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真菌在现代工农业生产中被广泛应用,具有重要的经济价值。但是真菌菌株在培养过程中通常会发生退化,而不可逆的、可遗传的菌株退化常常造成巨大的商业损失。丝状真菌退化菌株的形态和生化异常现象已有广泛的记载,但是触发退化的遗传机制仍未可知。绿僵菌不但可以感染昆虫,还能与植物形成互惠共生的关系,已被开发成了真菌杀虫剂和生物肥料,广泛用于防治农林业害虫、卫生害虫以及它们所传播的疾病。在前期工作中,在绿僵菌的模式研究菌种罗伯茨绿僵菌（Metarhizium robertsii）的T-DNA插入文库中,我们发现了一个出现退化表型（菌落角变）的突变体。以此为基础,本研究发现液泡精氨酸转运蛋白基因Vae（Vacuolar arginine exporter）突变触发罗伯茨绿僵菌菌株退化,并进一步揭示了该突变引发菌株退化的机制,主要取得了如下研究结果。1.Vae基因编码一个具有PQ-loop结构域和七个跨膜区域的蛋白。VAE蛋白定位于液泡膜上,其C端具有两个保守的双亮氨酸片段,它们是VAE蛋白定位液泡膜所必须的。VAE蛋白与酿酒酵母YPQ2蛋白的功能类似,VAE蛋白能定位在酿酒酵母的液泡膜上,并能回补酵母的Ypq2基因突变体。VAE蛋白的功能是将液泡中的精氨酸输出到细胞质中;与野生型菌株相比,基因敲除突变体（35）Vae的液泡中积累精氨酸,而细胞质中的精氨酸含量减少。Vae的同源基因在真菌中广泛存在。2.突变体（35）Vae发生了退化:与野生型菌株相比,该突变体细胞凋亡和线粒体膜电位崩溃程度增加,ROS水平升高,分生孢子产量降低,致病昆虫的能力下降,孢子和菌丝中脂滴形成异常,三酰甘油含量降低。连续传代导致突变体（35）Vae退化程度持续加深:与在PDA上连续传代3次所得菌株相比,连续传导7次所得菌株的分生孢子产量和对昆虫的致病性更低,细胞凋亡和线粒体膜电位崩溃程度更严重,细胞内累积的ROS水平更高,脂滴的数量更少,三酰甘油含量更低。向（35）Vae连续传代所得菌株中导入野生型Vae基因能使传代3次所得菌株的表型恢复到野生型菌株的水平,但是不能恢复传代7次所得菌株的表型;向培养基中添加精氨酸也不能恢复传代7次所得菌株的表型,表明连续传代使得突变体（35）Vae发生了不可逆退化。连续传代导致（35）Vae退化程度持续加重的现象在比PDA培养基营养更丰富的SDY培养基和营养更贫瘠的M-100培养基上均存在,表明这种现象与环境营养水平无相关性。3.Vae基因失活抑制G蛋白信号通路调控基因cag9的表达引发菌株退化。RNASeq分析发现,Vae基因的敲除导致86个基因表达下调,33个基因表达上调。其中,一个G蛋白信号通路调控蛋白（命名为conidiation association gene 9:CAG9）表达下调。进一步用反义RNA技术构建了cag9基因表达水平降低的突变体;分析这些突变体表明,cag9基因表达量下降引起菌株退化,表型为分生孢子产量降低,对昆虫的致病性降低,细胞凋亡和线粒体膜电位崩溃程度增强,ROS水平升高。4.Vae基因失活抑制Vse1基因的表达,导致菌株致病昆虫的能力和定殖植物根际的能力下降,孢子萌发延迟。进一步发现,成熟孢子中有高水平的Vse1基因的m RNA,其在昆虫体壁上萌发初期急剧下降,但在附着胞形成阶段再次升高。成熟孢子也含有高水平的VSE1蛋白,在孢子萌发时蛋白水平迅速下降,所剩蛋白主要集中在孢子萌发时的出芽部位。与野生型相比,Vse1敲除突变体在昆虫体壁上、1/2 SDY培养基和无营养的水中萌发速度均显著下降;但是在水中添加氨基酸可以缩小突变体和野生型菌株之间孢子萌发速度的差异。综上,我们发现了一种诱发罗伯茨绿僵菌菌株退化的有害突变,并揭示了该突变引发退化的关键机制。本研究显著加深了对真菌退化诱因机制的认识,为更好地利用绿僵菌进行生物防治提供了理论依据。
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