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阿霉素(doxorubicin,DOX)虽然是较常用的化疗药物之一,但其靶向性差,毒副作用强,长期使用会产生多药耐药(multidrug resistance,MDR),使其应用受限。Heparosan多糖是一种天然多糖,具有良好的生物相容性,生物可降解性和长循环性。因此,构建基于heparosan多糖给药系统,可以增强DOX的靶向性、降低毒副作用、提高治疗效果。维生素E琥拍酸酯(Vitamin E Succinate,VES)目前被认为是可以通过抑制P-gp外排泵克服肿瘤MDR的疏水性材料。故本文采用VES分子对heparosan多糖进行修饰,并用含有还原敏感的二硫键作为连接体,制备了具有体内长循环、逆转肿瘤MDR功能和还原敏感释药的两亲性共聚物HR-CYS-VES(KSV),同时合成无敏感的HR-ADH-VES(KV),包载模型药物DOX并在水中自组装形成载药胶束(DOX/KV,DOX/KSV)。进一步研究了其制剂学理化性质,细胞毒性,细胞摄取,细胞摄取机制及逆转肿瘤MDR性质。(1)DOX/KV胶束的制备与评价合成heparosan多糖-维生素E琥珀酸酯(HR-ADH-VES,KV)载体,利用’HNMR对其结构进行确证。以DOX为模型药物,制备载药胶束DOX/KV,并对其性质进行表征。结果表明,制备胶束形貌为均一的球形,粒径＜200nm,zeta电位为-20 mV左右,包封率约为80%,载药量为10%~15%,并具有一定的pH敏感性和β-葡萄糖醛酸酶敏感性。选择MGC80-3肿瘤细胞和COS7正常细胞考察体外细胞毒性和细胞摄取情况。结果显示,空白胶束具有良好的生物相容性,DOX/KV对MGC80-3细胞的细胞毒性要大于COS7细胞,且在MGC80-3细胞中的摄取效率更高。上述结果说明,KV可以很好地包载DOX,并且可以提高其对癌细胞的选择性,具有良好的抗肿瘤活性。(2)还原敏感型DOX/KSV胶束的制备与评价为了增加肿瘤选择性并改善DOX的治疗效果,构建了新型还原敏感胶束heparosan-胱胺-维生素E琥珀酸酯(HR-CYS-VES,KSV)。具有球形形态的载药胶束(DOX/KSV)平均粒径为90-120 nm,zeta电位为-20 mV左右,且具有较好的血清稳定性和还原触发的解聚现象。DOX/KSV的包封率约为90%,载药量为13%~16%,表明KSV可以很好地包载DOX。体外药物释放实验表明,与对照组DOX/KV相比,DOX/KSV胶束具有良好还原敏感触发释药行为。利用MGC80-3细胞和COS7细胞作为细胞模型,考察体外细胞毒性和细胞摄取情况。体外细胞毒性结果显示,空白胶束的细胞存活率均大于90%,DOX/KSV在MGC80-3细胞中的细胞毒性高于COS7细胞,说明载体具有较好的生物相容性和较小的毒副作用。对于MGC80-3细胞,还原敏感性胶束DOX/KSV的细胞毒性显著大于游离DOX和非还原敏感性胶束DOX/KV。利用流式细胞仪分析和激光共聚焦扫描显微镜对细胞摄取情况进行观察,结果表明,相较于DOX/KV,DOX/KSV胶束内在化之后进入细胞后药物更快释放并进入细胞核。此外,利用MGC80-3细胞研究DOX/KV与DOX/KSV细胞摄取机制,结果表明,DOX/KV、DOX/KSV通过多种途径内吞进入细胞主要为网格蛋白介导的内吞途径。(3)DOX/KV、DOX/KSV 逆转 MDR 研究选择MCF-7和其耐阿霉素细胞MCF-7/ADR作为细胞模型,进行体外细胞毒性和细胞摄取试验研究DOX/KV、DOX/KSV逆转MDR的作用。体外细胞毒性实验显示,游离DOX耐药指数显著高于DOX/KV、DOX/KSV,而游离DOX的逆转耐药指数却小于DOX/KV、DOX/KSV,表明DOX/KV、DOX/KSV具有逆转肿瘤MDR的作用。细胞摄取实验表明,DOX/KV、DOX/KSV细胞摄取量显著高于游离DOX,同样表明表明DOX/KV、DOX/KSV具有逆转肿瘤MDR的作用。溶酶体逃逸实验结果表明,还原敏感胶束DOX/KSV可以更快释放药物入核,同时胶束结构会拆解释放游离VES发挥作用,故DOX/KSV具有更好的逆转肿瘤MDR的作用。利用MCF-7/ADR细胞检测可以促进细胞凋亡的活性氧含量,结果显示,相对于游离DOX和DOX/KV,DOX/KSV可以显著增加胞内活性氧含量,说明DOX/KSV促进药物的释放和细胞的凋亡,从而逆转肿瘤MDR。