由于诱导多能性干细胞在再生医学领域中重要的潜在应用价值,其进而成为近年的科研热点。随着研究的深入,诱导机制、诱导方法、诱导效率、临床应用以及建立不同物种诱导多能干细胞系等方面都得到显著的进展。目前,小鼠,大鼠,人类,恒河猴以及猪等物种的诱导多能干细胞系均已经成功建立。然而,成功建立绵羊诱导多能干细胞系的报道相对较少,并且效率低下。本研究通过逆转录病毒质粒传递系统,以小鼠来源的Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc 4个多能性基因以及miR-200c和miR-302 2个microRNA作为诱导因子,导入绵羊胚胎耳尖成纤维细胞,获得绵羊诱导多能性干细胞,并且进行多能性检测。为建立绵羊iPS细胞系方法的完善及探明绵羊iPSCs诱导机制奠定了基础。研究结果如下:1.诱导因子和实验细胞的准备:无内毒素提取携带Oct4、Sox2、klf4、c-Myc、miR-200c和miR-302的逆转录病毒载体,经过纯化进一步提高质粒浓度和纯度。双酶切鉴定后均出现理论长度的片段。应用胰酶消化法制备小鼠胚胎成纤维细胞和绵羊胚胎耳尖成纤维细胞。丝裂霉素C处理两种细胞制备饲养层。复苏包装病毒的Plat-E细胞。所有细胞均成功分离、培养、冻存及复苏。2.绵羊诱导多能性细胞系的建立:脂质体转染6个诱导因子,收集并浓缩Plat-E细胞包装的逆转录病毒,进而侵染绵羊胚胎耳尖成纤维细胞,然后在含有白血病抑制因子和碱性成纤维细胞生长因子的胚胎干细胞培养基中培养。5天后出现类似胚胎干细胞的细胞集落克隆。经过多次传代与筛选,构建绵羊诱导多能性细胞系。3.绵羊诱导多能性细胞的检测:对获得的诱导多能干细胞进行碱性磷酸酶活性和Oct4免疫荧光染色检测检测,其结果均为阳性。提取诱导多能干细胞的基因组DNA,经甲基化处理后,扩增Sox2启动子区域的甲基化岛,检测去甲基化状态。结果发现,在诱导多能干细胞中,Sox2启动子区域具有7.04%的甲基化程度,绵羊成纤维细胞具有72.96%的甲基化程度,说明在重编程后出现显著的去甲基化。综上所述,利用鼠源因子诱导绵羊体细胞,成功构建绵羊诱导多能性干细胞系。