研究背景辅助生殖技术已成为解决不孕不育问题的重要技术手段,它的快速发展使得胚胎质量问题得到解决,但薄型子宫内膜所引起的子宫内膜容受性改变仍是辅助生殖技术中周期取消以及胚胎植入失败的主要因素之一[1]。目前加拿大的生殖和男科学会（CFAS）及《辅助生殖技术中异常子宫内膜诊疗的中国专家共识》中将薄型子宫内膜定义为子宫内膜在排卵日或新鲜体外受精（IVF）周期中注射人绒毛膜促性腺激素（Human chorionic gonadotropin,HCG）当天或冻融胚胎移植（Freeze-thaw embryo transfer,FET）周期中开始孕酮的当天未达到7mm[2-3]。但薄型子宫内膜并不仅限于内膜变薄,还包括内膜功能层血流异常、影响内膜容受性因子的改变等多种子宫内膜容受性改变。临床上对于薄型子宫内膜的治疗主要包括基础激素治疗、子宫内膜微创刺激术激发免疫应答、低剂量阿司匹林的应用及促基质、血管形成等,从而起到增加子宫内膜的厚度、改善血流等容受性作用。但由于上述治疗方法的临床效果不确切,且患者的个体差异也较大,因此治疗效果并不理想,急需探寻新的有效治疗方式。随着再生医学的兴起及研究,在其领域中具有独特优势的干细胞成为当今研究的热点,它具体自我更新及多向分化潜能等特性,迄今已广泛应用于多个医学领域。其中便有关于将干细胞应用于子宫内膜修复并成功妊娠的报道[4]。尽管有成功的报道,但其来源受限、创伤大及免疫原性等限制了干细胞应用。近些年随着干细胞领域研究的不断深入,优势明显的经血子宫内膜间充质干细胞（Endometrium mesenchymal stem cells,EnMSCs）的研究也有了重大突破。EnMSCs具有较高的增殖活性,同时还能够向骨、脂肪、肌细胞和软骨细胞等分化,具有极强的多向分化潜能。体外细胞实验研究表明:在雌激素的诱导下,EnMSCs可以向子宫内膜上皮细胞分化[5]。在动物模型中,EnMSCs可重建子宫内膜组织并增加子宫内膜厚度[6]。Tan[7]及Zheng[8]等将经血源性EnMSCs移植治疗重度阿什曼综合征也取得良好疗效。以上研究结果均提示,每个月经周期子宫内膜的生长及功能恢复必定离不开EnMSCs的重要作用。但体外干细胞应用的远行归巢及局部定植非常困难,且临床治疗所需干细胞数量大,复制扩增过程中添加的胎牛血清及异体源性生长因子的加入亦有悖于伦理学范畴。能否寻求一种安全有效的自体资源培养干细胞;更有趣的是,假想这种自体资源能唤醒在体干细胞的功能,便能达到事半功倍的治疗效果。富血小板血浆（Platelet-richplasma,PRP）为一种高浓度的血小板血浆,可由静脉血离心得到。血小板内含有α-颗粒,其激活破裂时可释放出多种生长因子,如转化生长因子（Transforming growth factor,TGF）、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）、血小板源性生长因子（Platelet derived growth factor,PDGF）、表皮生长因子（Epidermal Growth Factor,EGF）和胰岛素样生长因子（Insulin like growth factor,IGF）等,这些生长因子能够促进细胞增殖、迁移等生物活性的改变,使损伤部位的生物微环境明显得到改善,从而促进组织和新生基质的形成,以达到组织修复和再生的功能,对于损伤后伤口愈合具有积极作用[9]。并且,PRP具有操作简单、安全经济、损伤小等自身特有的优点,故广泛应用于骨科、口腔、皮肤、美容整形等[10-12]。基于以上基础理论研究及相关应用,PRP的应用也逐步引入生殖领域,这为薄型子宫内膜的治疗引入了新的安全有效的自体生物材料。鉴于薄型子宫内膜需要得以治疗的迫切性,干细胞治疗有效但应用受限、难以推广及含有多种生长因子的自体PRP可影响多种细胞功能、应用安全等优良特性,我们设计了此课题,初步探讨PRP在治疗薄型子宫内膜方面的作用。研究目的首先探讨PRP对EnMSCs增殖、迁移和粘附的生物学功能影响;然后用95%乙醇宫腔灌注制作薄型子宫内膜小鼠模型,通过观察薄型子宫内膜小鼠宫腔灌注PRP后子宫内膜的形态学、容受性指标及在体EnMSCs标记物的变化,探讨PRP治疗薄型子宫内膜的效果及潜在机制;最后将自体PRP宫腔灌注应用到拟行FET的薄型子宫内膜患者中,观察宫腔灌注PRP治疗薄型子宫内膜的临床效果;以期寻找到一种治疗薄型子宫内膜的新的有效方法。研究方法1.采集5名健康志愿者静脉血,采用两步离心法分离制作并激活PRP。采用流式细胞仪检测EnMSCs表面标志物CD14、CD19、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、HLA-DR的表达;采用成脂、成骨及成软骨分化培养液培养EnMSCs,观察细胞形态以及脂滴、矿化结节及软骨形成情况完成鉴定。利用添加不同浓度PRP的培养液培养EnMSCs,采用CCK-8（Cell Counting Kit-8）法绘制各组细胞在24h、48h、72h、96h的增殖曲线;采用Transwell法和划痕实验检测不同浓度PRP对EnMSCs迁移及粘附能力的影响。2.95%乙醇宫腔灌注制作薄型子宫内膜小鼠模型,给予宫腔灌注PRP治疗后,通过HE染色观察子宫内膜厚度、面积及微血管的改变;通过免疫组化、ELISA和Western-blot检测子宫内膜功能及容受性指标:细胞角蛋白（Cytokeratin）、波形蛋白（Vimentin）、VEGF、白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor,LIF）和白介素-6（Interleukin-6,IL-6）;通过免疫荧光双染方法检测小鼠EnMSCs的表面标记物:CD90和CD105,观察EnMSCs的在体变化情况,探讨宫腔灌注PRP修复薄型子宫内膜的效果和机制。3.采集20名行FET治疗的薄型子宫内膜不孕患者自身静脉血,2步离心法分离制作PRP,同周期宫腔内无菌灌注,且继续人工周期替代治疗。当子宫内膜达到移植厚度（≥7mm）时,添加孕激素转换内膜行FET。提供适当的黄体期支持并测量血清β-HCG水平。计算并分析子宫内膜厚度、形态及血流情况,并进行阳性β-HCG和临床妊娠情况等随访。结果（1）将不同浓度PRP加入培养液对EnMSCs进行体外培养发现:不同浓度PRP对EnMSCs的增殖具有不同程度的影响,2%PRP组的EnMSCs的增殖活性最大;1%PRP组和4%PRP组EnMSCs的增殖活性略低于2%PRP组;5%PRP组和0.5%PRP组的EnMSCs的增殖活性最弱（p<0.01）。（2）PRP可以促进EnMSCs的迁移。其中,2%PRP培养液培养的EnMSCs的迁移率最大;1%PRP组和4%PRP组EnMSCs次之;5%PRP组和0.5%PRP组EnMSCs的迁移率最小。（3）不同浓度的PRP对EnMSCs的粘附能力影响也不同:2%PRP培养液培养的EnMSCs的粘附能力最强（p<0.01）,其余各组粘附能力无明显差异（p>0.05）。（4）通过制作小鼠薄型子宫内膜模型行宫腔灌注PRP治疗后发现:宫腔灌注PRP可以改善薄型子宫内膜小鼠的子宫内膜容受性,包括子宫内膜形态学改善（内膜厚度、面积及微小血管的增加）和子宫内膜容受性指标的提高（CK9、VIM、VEGF、LIF）;此外,PRP还能抑制炎性因子IL-6的释放。免疫荧光追踪到小鼠EnMSCs在子宫内膜的表达情况,发现PRP宫腔灌注后在体EnMSCs增多。（5）通过观察自体PRP宫腔灌注治疗行FET的薄型子宫内膜患者的临床效果发现:20名患者中,接受PRP治疗前,患者的子宫内膜平均厚度为5.55±0.71 mm,PRP治疗后子宫内膜平均厚度为7.82±1.04 mm（p<0.0001）,且其子宫内膜形态及内膜血流信号也明显得到改善（分别是1.95±0.40 vs 2.75±0.44、2.60±0.50vs 3.40±0.68）。PRP宫腔灌注后所有患者子宫内膜达到移植厚度,其中有12例患者获得临床妊娠,妊娠率达60%,种植率为39.4%,早期流产率为16.7%。结论1.本研究使用不同浓度PRP体外培养EnMSCs,发现在2%PRP浓度范围内,细胞的增殖能力、迁移能力和粘附能力随着PRP浓度的升高而增强,呈剂量依赖性,而采用更高浓度PRP作用后上述作用则表现出回落现象,提示不同浓度PRP对EnMSCs的作用效果不同。首次验证PRP对EnMSCs的增殖、迁移和粘附的影响及与其浓度的关系。2.PRP可替代FBS及单一生长因子培养EnMSCs,为EnMSCs治疗薄型子宫内膜及其它疾病的临床应用提供扩增支持。3.PRP宫腔灌注薄型子宫内膜小鼠,可促进受损子宫内膜增殖修复,改善子宫内膜的容受性,减轻子宫内膜炎症反应。这种作用可能跟PRP影响在体EnMSCs的生物学功能有关。4.PRP宫腔灌注治疗薄型子宫内膜不孕患者,能够增加其子宫内膜厚度、改善血流,避免了周期取消,有利于胚胎植入以获得临床妊娠,且并未增加孕产妇并发症及子代出生畸形的风险。