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动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是一种复杂的慢性炎症性累及血管的疾病。随着动脉粥样硬化疾病的进展,大多数易损斑块的特征在于血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）的凋亡增加。除细胞凋亡外,新出现的证据支持血管细胞自噬的诱导可能在细胞对各种重要的致动脉粥样硬化应激源（如氧化脂质和脂蛋白）的反应中起重要作用。而迄今对AS斑块形成过程自噬在VSMCs过度凋亡中扮演的角色了解甚少。丹皮酚（Paeonol,Pae）是毛茛科植物牡丹的干燥根皮及萝摩科植物徐长卿的干燥根及根茎中的有效成分之一。课题组前期研究发现Pae可以减轻实验性鹌鹑、家兔AS斑块形成;抑制大鼠内皮细胞ECs（endothelial cells）凋亡;上调细胞自噬活性抑制VSMCs异常增殖。然Pae对VSMCs过度凋亡是否具有调控作用还需进一步探讨。本课题在前人研究基础上,采用ApoE-/-小鼠复制AS模型,以VSMCs为靶细胞,以ox-LDL（oxygenized low density lipoprotein）为损伤因子,诱导VSMCs凋亡,探求自噬在VSMCs凋亡过程中的调控机制及Pae的干预作用,深化对AS疾病的了解,并为研究药物对AS治疗的新靶点提供科学依据。目的:本实验首先明确Pae对粥样斑块期ApoE-/-小鼠主动脉VSMCs凋亡和自噬的影响,进一步观察ox-LDL对VSMCs凋亡和自噬的影响及Pae的保护作用。方法:高脂饲料喂养ApoE-/-小鼠复制AS动物模型;主动脉中膜的分离及总蛋白提取;western blot法检测主动脉中膜中LC3Ⅱ、p62、caspase-3蛋白的表达;组织块预消化贴壁法原代培养ApoE-/-小鼠VSMCs,采用免疫荧光技术鉴定VSMCs;ox-LDL与小鼠VSMCs共孵育复制损伤模型;cck8检测细胞存活率;流式细胞仪检测VSMCs的凋亡率;MDC检测VSMCs自噬活性;DAPI检测VSMCs凋亡率;投射电镜观察自噬小体和凋亡小体;western blot法检测VSMCs中LC3Ⅱ、p62、caspase-3、ⅢPI3K、Becline-1蛋白的表达。结果:1丹皮酚对ApoE-/-小鼠主动脉中膜VSMCs凋亡及自噬的影响高脂饲养ApoE-/-小鼠复制AS模型,Pae可上调AS小鼠主动脉VSMCs内LC3Ⅱ,下调caspase-3和p62的表达。2 ox-LDL损伤VSMCs的量效时效关系加入含ox-LDL不同浓度（50、100、150、200、250μg/mL）培养液分别刺激12、24、48h,用cck8检测VSMCs细胞生存率。ox-LDL作用后,细胞生存率受到明显的抑制。ox-LDL在150-250μg/mL浓度范围内刺激12、24h后,呈浓度依赖性刺激VSMCs生存率降低,结合时效和量效结果,我们选择150μg/mL,刺激VSMCs24h,为ox-LDL降低细胞生存率最佳的浓度与时间。3丹皮酚对ox-LDL损伤VSMCs的保护作用量效时效关系预先给予含不同浓度的Pae（15、30、60、120、240μM）分别刺激12、24、48h,接着吸弃丹皮酚,再加入150μg/mL的ox-LDL刺激24h,采用CCK8法检测VSMCs的存活率。Pae预先给药24h后随着Pae浓度的增加,与ox-LDL组相比,细胞生存率显著上升（P<0.01或P<0.05）;为进一步明确Pae抑制VSMCs凋亡的作用,结合前部分实验结果,我们采用流式细胞术进行验证,我们发现与control组相比,ox-LDL组细胞凋亡率显著上升,Pae各组细胞凋亡率较ox-LDL组凋亡率显著下降,呈剂量依赖性。4丹皮酚对VSMCs内自噬和凋亡的影响Pae浓度依赖性的增强MDC阳性细胞的荧光强度,细胞内MDC荧光颗粒数目明显增加。荧光强度随Pae给药剂量增强呈正比。ox-LDL组大部分细胞核质浓染,发白发亮,细胞核呈现不规则形状,凋亡阳性细胞明显增多,Pae各组呈剂量依赖性的减少凋亡阳性细胞。ox-LDL组有少量自噬小体形成,可见明显的凋亡小体脱落,Pae各组有一定数量的自噬小体形成,偶见凋亡小体脱落;ox-LDL组细胞LC3Ⅱ蛋白略有上升,p62、caspase-3蛋白水平升高,与control组比较有显著差异（P<0.01或P<0.05）,各Pae组细胞LC3Ⅱ蛋白明显上升,p62、caspase-3蛋白水平显著下降（P<0.01）。5丹皮酚调控VSMCs凋亡的分子机制3-MA可以翻转Pae增加自噬蛋白LC3Ⅱ,减少自噬蛋白p62、凋亡蛋白caspase-3在VSMCs胞浆内的表达的结果,表明Pae可能通过诱导自噬来抑制凋亡的发生。DAPI实验进一步显示3-MA抵消Pae抑制凋亡的作用,明确Pae上调自噬抑制VSMCs凋亡的作用;此外,Pae激活VSMCs内ⅢPI3K/Becline-1信号通路;ⅢPI3K和Becline-1干扰抵消Pae上调自噬蛋白LC3Ⅱ,下调自噬蛋白p62与凋亡蛋白caspase-3的表达,表明Pae可能通过诱导了ⅢPI3K/Becline-1自噬途径抑制凋亡。DAPI实验进一步显示ⅢPI3K和Becline-1干扰翻转丹皮酚抑制凋亡的作用,明确Pae可能通过诱导了ⅢPI3K/Becline-1自噬途径抑制凋亡。结论:1.Pae抑制主动脉VSMCs过度凋亡,上调VSMCs主动脉自噬活性。2.Pae可能通过上调ox-LDL诱导的体外VSMCs细胞自噬活性抑制其过度凋亡。3.Pae可能通过激活ⅢPI3K/Becline-1自噬途径抑制VSMCs凋亡。