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背景载脂蛋白O(apolipoprotein O, apoO)是2006年新发现的一种载脂蛋白,目前对其生理功能的认识知之甚少。生理情况下apoO的平均血浆浓度极低,仅为2.21±0.83μg/ml。即使分泌型apoO主要存在于高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)中,但apoO与HDL胆固醇水平及其他血脂成分并无相关性,且过表达apoO也不影响HDL的质量和功能,提示分泌到血浆中的apoO作用十分有限。除作为分泌型蛋白在细胞外发挥作用,apoO还可滞留于细胞内调节细胞代谢。急性冠脉综合征(acute coronary syndrome, ACS)患者apoO的血浆浓度明显升高,并且与炎症指标高敏C反应蛋白(high-sensitivity C-reactive protein, hs-CRP)水平呈显著正相关性,由此推测apoO可能与机体炎症状态有关。与此一致的是,采用小RNA干扰(small interfering RNA, siRNA)技术沉默细胞内apoO表达后,多种炎症相关基因的表达明显改变,但apoO是否在细胞内发挥调节炎症应答的作用及可能的调节途径均尚属未知。基于脂肪细胞可大量合成apoO,而脂肪细胞炎症激活所致分泌功能异常在肥胖及动脉粥样硬化的发生、发展中具有重要作用,深入探讨内源性apoO对脂肪细胞分泌功能的影响,对揭示apoO的生理功能以及肥胖等相关疾病的发病机制具有重要意义。目的探讨内源性apoO是否参与调控脂肪细胞炎症应答,以及apoO影响脂肪细胞分泌功能的可能作用机制。方法一.载脂蛋白O对人脂肪细胞分泌功能的影响由行腹部外科手术的患者少许皮下脂肪组织中分离培养得人脂肪源间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells, ADSCs),继而诱导分化为成熟的人脂肪细胞。采用流式细胞术及油红O染色法鉴定脂肪细胞。构建含人apoO-siRNA的慢病毒表达载体并包装好后,以低浓度氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)(12.μg/ml)分别干预正常人脂肪细胞或转染了apoO-siRNA慢病毒颗粒的脂肪细胞,采用real-time PCR检测apoO、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、单核趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α) mRNA水平；western blot法检测apoO蛋白表达；ELISA法检测细胞上清液炎性细胞因子IL-6、MCP-1、TNF-α蛋白水平。二.载脂蛋白O调节脂肪细胞分泌功能的可能作用机制人ADSCs以促分化液促分化14天,或于促分化第4天行慢病毒转染沉默apoO表达并继续诱导分化成熟后,以低浓度ox-LDL (12.5μg/ml)分别干预上述两种脂肪细胞,real-time PCR检测Toll样受体4(Toll-like receptor4, TLR4)、髓样分化因子88(myeloid differentiationprimary response protein88, MyD88)、白介素-1受体相关激酶4(IL-1receptor-associated kinase4, IARK4)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNF receptor associated factor6,TRAF6) mRNA水平变化；western blot法检测TLR4、核因子κB抑制蛋白α (inhibitor of nuclear factor-κB-a,IκBα)及磷酸化IκBα(phosphorylated IκBα Phospho-IκBα)的表达情况。三.载脂蛋白O调控TLR4/NF-κB信号通路方式的探讨促分化成熟的人脂肪细胞用低浓度ox-LDL(12.5μg/ml)干预24小时,对比观察刺激前后如下情况：①免疫荧光法观察apoO在脂肪细胞内的定位；激光共聚焦检测细胞内apoO与caveolin-1的分布关系；②蔗糖密度梯度离心法处理细胞,观察apoO在小凹区域的分布；③免疫共沉淀法检测apoO与caveolin-1是否存在互相作用。另于诱导分化第4天行慢病毒转染沉默细胞内apoO表达并继续诱导分化至成熟后,检测细胞内胆固醇含量变化。结果一.载脂蛋白O对人脂肪细胞分泌功能的影响1.成功提取人脂肪源间充质干细胞并诱导分化为成熟的人脂肪细胞；2.构建的apoO-siRNA慢病毒颗粒能有效抑制人脂肪细胞中apoO mRNA及蛋白的表达(P<0.005)；3.与对照组相比,低浓度ox-LDL刺激后,人脂肪细胞内apoO表达增加并伴促炎细胞因子IL-6、MCP-1、TNF-α合成减少(P<0.01)；4.有效沉默细胞内apoO表达后,低浓度ox-LDL刺激可明显增加IL-6、MCP-1、TNF-α等促炎细胞因子的合成与分泌(P<0.01)。二.载脂蛋白O调节脂肪细胞分泌功能的可能作用机制1.与对照组相比,低浓度ox-LDL刺激后,人脂肪细胞内TLR4表达无显著变化(P>0.05)；2.低浓度ox-LDL刺激人脂肪细胞可明显抑制TLR4/NF-κB信号通路活性(P<0.05)；3.有效沉默细胞内apoO表达后,低浓度ox-LDL刺激可激活TLR4/NF-κB信号通路(P<0.05)。三.载脂蛋白O调控TLR4/NF-κB信号通路方式的探讨1.基础状态下,人脂肪细胞内apoO定位于胞浆脂滴膜上；低浓度ox-LDL刺激后,apoO可移至胞膜小凹区域与caveolin-1共定位；2.免疫共沉淀检测发现,apoO与caveolin-1可发生相互作用；3.有效沉默apoO表达后,脂肪细胞内胆固醇含量无明显变化(P>0.05)。结论1.内源性apoO介导了低浓度ox-LDL对脂肪细胞IL-6、MCP-1、 TNF-α等促炎细胞因子合成与分泌的抑制作用；2. ApoO可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路发挥对脂肪细胞炎症反应的调节作用；3. ApoO与caveolin-1的结合是其抑制TLR4/NF-κB信号通路活性的机制之一；apoO的抗炎作用并不依赖于细胞内胆固醇含量的变化。