乳腺癌是目前世界上威胁女性生命健康的癌症中的头号杀手,近年来我国乳腺癌患病女性人数正不断增加,发病率居高不下。紫杉醇是临床常用的乳腺癌化疗药物,但由于其诸多副作用,如肠道反应、神经毒性、骨髓抑制等,对患者身体造成极大的影响。肠道是机体代谢和免疫的重要器官,肠道黏膜屏障与肠道菌群之间相互作用,对维持人体健康起重要作用。同时,肠道菌群可通过干预宿主免疫反应而影响肿瘤的发生与治疗。灵芝孢子提取物（Extraction from Spore of Ganodermalucidum,ESGL）是灵芝孢子破壁后经水提醇沉与透析后制备所得的提取物,具有免疫调节、抗肿瘤等生理活性,但其在辅助肿瘤化疗增效减毒方面的研究鲜有报道。因此本研究通过观察灵芝孢子提取物联合紫杉醇增强其抗乳腺癌的潜在作用,及其对紫杉醇引起的肠黏膜损伤的修复作用,为灵芝孢子在常规化疗中的辅助用药提供理论依据。目的:研究灵芝孢子提取物协同紫杉醇增强其抗乳腺癌的潜在作用,及其对紫杉醇引起的肠黏膜损伤的修复作用。方法:1.灵芝孢子提取物联合紫杉醇增强其抗乳腺癌活性的作用研究（1）噻唑蓝法（MTT）检测灵芝孢子提取物联合紫杉醇对乳腺癌4T1细胞活性的影响;（2）取BALB/c小鼠,分为正常组（Normal）,模型组（Model）,紫杉醇组（PTX,12.5mg/kg）,灵芝孢子提取物联合紫杉醇用药组（ESGL+P,100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg）。除Normal组外,其余各组通过腋下皮下注射4T1细胞（1×105个/只）建立乳腺癌移植瘤模型。从造模第二天开始,PTX组每周腹腔注射紫杉醇两次（10mL/kg/次,i.p.）;联合用药组除接受紫杉醇注射外,每天灌胃相应剂量ESGL（10mL/kg/天）,正常组和模型组给予等体积的生理盐水,连续用药21天并观察;（3）实验进行过程中,观察并记录荷瘤小鼠体重变化和肿瘤生长情况;实验结束后,采集血液,剖取胸腺、肿瘤、小肠,称量瘤重,进行后续实验;（4）流式细胞术（Flowcytometry Analysis,FCM）检测荷瘤小鼠外周血、胸腺、肿瘤微环境（肿瘤浸润淋巴细胞,TILs）中T淋巴细胞（T lymphocyte,T）及其主要亚群比例,包括辅助性T细胞（Helper T cell,Th）、细胞毒性T细胞（Cytotoxic Tcell,Tc）,以及其中共刺激因子白细胞分化抗原28（CD28）和疫监测点蛋白,包括序性死亡受体1（PD-1）、细胞毒T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）、T淋巴细胞免疫球蛋白及黏蛋白域3（Tim-3）的表达水平。2.灵芝孢子提取物对紫杉醇诱导小肠黏膜损伤的修复作用研究（1）所得小肠部位（距回肠结上端1cm处）,通过苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-Eosin staining,HE）观察小肠组织结构,采用原位末端转移酶标记技术（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,TUNEL）检测小肠细胞凋亡水平,并通过免疫组织化学技术（Immunohistochemistry,IHC）检测其中增殖细胞核抗原（PCNA）的表达水平;（2）应用蛋白印迹法（Western Blotting,WB）检测小肠上皮连接蛋白表达水平,包括紧密连接蛋白1（ZO-1）、钙粘蛋白E（E-cadherin）、β连环蛋白（β-catenin）、闭合蛋白（Occludin）;同时使用实时荧光定量聚合酶链式反应法（Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-qPCR）检测小肠上皮连接蛋白基因表达水平;最后部分使用酶联免疫吸附测定法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA）检测荷瘤小鼠血清中内毒素（Lipopolysaccharide,LPS）含量水平。3.灵芝孢子联合紫杉醇对乳腺癌小鼠肠道菌群的影响利用二代测序技术对受试动物盲肠内容物中菌群16S rRNA进行测序,分析其中肠道微生物组成及结构。结果:1.灵芝孢子提取物联合紫杉醇抑制小鼠乳腺癌的增效作用研究（1）MTT结果显示,紫杉醇作用于乳腺癌4T1细胞48h与72h的半数抑制浓度（IC50）值分别为243.2ng/mL和151.9ng/mL;灵芝孢子提取物联合紫杉醇（IC50）作用于乳腺癌4T1细胞48h和72h后,与紫杉醇单独用药相比,4T1细胞的存活率无显著变化,说明灵芝孢子提取物对紫杉醇引起的细胞毒作用无明显影响。（2）观察测量发现,与模型组相比,紫杉醇组的肿瘤组织的生长速度与肿瘤重量明显下降;与紫杉醇组相比,联合用药组的肿瘤生长速度与重量进一步下降,表明灵芝孢子提取物在体内能增强紫杉醇的抗肿瘤活性。（3）流式细胞术分析T淋巴细胞及其免疫监测点蛋白结果显示,在外周血中,联合用药能显著促进T淋巴细胞、辅助性T细胞与细胞毒性T细胞内共刺激因子CD28蛋白表达,且降低T细胞中程序性死亡受体1（PD-1）蛋白的表达水平;在胸腺中,联合用药能提高初始T细胞（Na（?）ve Tcell,Tn）与效应T细胞（EffectorT cell,Te）的比例;在肿瘤微环境中,联合用药能显著降低Tc细胞内的PD-1、CTLA-4及Tim-3蛋白的表达水平,表明联合用药能增强机体免疫监控功能。2.灵芝孢子提取物对紫杉醇引起肠黏膜损伤的修复作用机制的研究（1）HE染色观察发现,灵芝孢子提取物能修复由紫杉醇干预所致的小肠黏膜结构损伤,使小肠肌层完整,绒毛长度恢复,绒毛排列紧密,接近正常状态;TUNEL法检测细胞凋亡结果显示,灵芝孢子提取物能显著减少由紫杉醇引起的小肠细胞凋亡;IHC法检测细胞增殖结果显示,灵芝孢子提取物能上调小肠黏膜中细胞增殖标记抗原（PCNA）的表达,显著促进小肠隐窝细胞增殖。（2）WB分析结果显示,紫杉醇单独用药明显抑制了小肠组织中ZO-1、E-cadherin、β-catenin以及Occludin等屏障蛋白的表达,而灵芝孢子提取物联合紫杉醇则可有效逆转上述情况;RT-qPCR检测结果显示,紫杉醇单独用药也显著下调了上述蛋白相应基因的mRNA表达,而联合用药可提高这些mRNA水平。此外,ELISA检测结果显示,与紫杉醇单独用药相比,联合用药可降低血清LPS的含量。3.灵芝孢子提取物联合紫杉醇对乳腺癌小鼠肠道菌群的影响（1）OTU分类鉴定结果显示,紫杉醇组与其他组相比,特有的OTU数目明显减少。（2）α-多样性分析结果显示,与正常组相比,模型组、紫杉醇组与联合用药组的肠道微生物菌群的Chao1指数和ACE指数均显著下降,说明联合用药组的微生物菌群丰富度有所降低。（3）β-多样性比较中,基于UniFrac距离的PCoA主坐标分析和ANOSIM相似性分析均表明,与正常组相比,模型组肠道微生物的群落结构相近,但存在一定差异;而紫杉醇组与联合用药都表现出明显差异。（4）分类学组成分析结果显示,肠道菌群的门和属分类上,正常组、模型组、紫杉醇组与联合用药组都表现出明显的差异。其中,联合用药组的Bacteroidetes显著高于正常组和紫杉醇组,而Firmicutes则无明显差别,结果导致两者之间的比值明显上升。LEfSe分析结果表明,在每组中都存在着几种优势菌群:在正常组中,Dorea与Ruminococcus的相对丰度最高;在模型组中含有丰富的Coprococcus、Parabacteroides以及Prevotella;紫杉醇组中的优势菌群主要为Desulfovibrio、Ochrobactru、Odoribacter和Turicibacter;联合用药组中的优势菌群主要为Bacteroides、Ruminococcus以及其余五种菌群。结论:首先灵芝孢子提取物与紫杉醇联合用药,可进一步降低肿瘤生长速度和重量,同时可增加荷瘤动物外周血和胸腺中T细胞及其亚群比例,并促进外周血中T细胞活化。此外,灵芝孢子提取物可降低肿瘤微环境中T细胞及其亚群中免疫监测点蛋白表达水平,表明灵芝孢子提取物可通过增强机体免疫监控功能,增强紫杉醇抗肿瘤的活性。第二,联合用药可修复紫杉醇引起的小肠结构的改变,减少肠细胞凋亡、恢复其增殖功能,并促进小肠上皮紧密连接蛋白及其对应基因的表达,降低血清LPS含量,表明灵芝孢子提取物可修复由紫杉醇引起的荷瘤小鼠肠黏膜屏障损伤,从而减轻紫杉醇对肠道的毒副作用。最后,联合用药还能改变肠道菌群多样性与丰富度,增加优势菌群种类数量,改善紫杉醇引起的肠道菌群失调。综上所述,灵芝孢子提取物与紫杉醇联用可增强其抗乳腺癌作用,并可减轻紫杉醇引起的肠黏膜屏障损伤,提示灵芝孢子提取物在癌症化疗辅助中具有潜在的应用价值。