白茶萎凋过程差异基因的分离与儿茶素类物质代谢关键酶基因的表达分析

来源 :福建农林大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:ghostwazy
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白茶主产于福建,传统白茶加工不炒不揉,鲜叶经过萎凋、干燥工序加工而成。萎凋是白茶品质形成的关键工序。白茶加工过程中酚类物质、氨基酸、糖类、芳香物质与白茶品质的形成密切相关。本研究以福鼎大白茶的鲜叶和萎凋叶为供试材料,采用DSN介导-抑制差减杂交技术,构建萎凋叶-鲜叶正向抑制差减cDNA文库,采用反向Northern-blotting技术,筛选含差异基因的阳性克隆,并将阳性克隆的测序结果进行ESTs分析和归类,并对差异基因进行生物信息学分析,预测其功能;采用荧光定量技术检测白茶品质形成相关差异基因在白茶萎凋过程中表达量的动态变化;从茶叶生化特性和分子水平方面对比白茶萎凋过程中茶多酚的变化差异及儿茶素生物合成途径关键酶基因的动态表达,以期为优化白茶的萎凋工艺提供参考依据,为优化白茶的萎凋工艺提供参考依据。主要研究结果如下:1.构建了萎凋叶-新鲜叶正向抑制差减cDNA文库,筛选出与白茶品质形成相关差异基因:DSN处理的最适浓度是1/2 U,差异cDNA扩增的最佳循环数是20,cDNA原始文库的滴度为5.1×104pfu/mL,插入克隆片段比例为93.5%,空载率比例为6.5%,插入片段的大小在650-2000 bp之间。反向Northern-Blotting筛选测序检测的300个克隆,阳性克隆共158个,计算所得阳性率为52.67%,阳性克隆的测序,结果表明有112条为已知的功能基因(占71%),有35条为推测的功能基因(占22%),有11条为未知基因(占7%)。找到与白茶品质相关的3个基因:S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因(SAMDC)、琥珀酸脱氢酶基因(SDH)和磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶基因(DAHPS)。2.筛选出适合白茶萎凋叶和鲜叶荧光定量PCR的内参基因:应用3个软件(GeNorm,NormFinder和BestKeeper)对7个常用内参基因进行筛选,获得3个稳定性较好的内参基因β-Actin、GAPDH和RUBP,RUBP适合作为白茶萎凋过程叶片荧光定量PCR的内参基因,β-Actin适合作为白茶不同叶位叶片荧光定量PCR的的最佳内参基因,因此,在白茶萎凋过程中,使用GAPDH+RUBP组合作为内参基因进行荧光定量PCR检测,可以功能基因的表达量进行校正。3.对获得的白茶品质形成相关基因(CsSAMDC、CsSDH和Cs DAHPS)进行了生物信息学分析与表达分析:(1)CsSAMDC基因的cDNA全长为1549bp,ORF为1073 bp,编码337个氨基酸,该氨基酸序列与茶树的同源性为87%、与香附子、小麦、菜豆、大豆同源性均为100%;荧光定量PCR结果表明,萎凋历时0h(鲜叶)至16h,萎凋后期即萎凋历时24h至52h,CsSAMDC呈现先上升后下降的趋势,在萎凋历时4h的相对表达量是最高的,是0h的4倍。(2)CsSDH基因的cDNA全长为1224 bp,ORF为1150bp,编码394个氨基酸,与荔枝、马尾松、葡萄、油棕的同源性均为100%;荧光定量PCR结果表明,萎凋历时0h至52h,CsSDH含量呈现缓慢下降的趋势,变化差异不大,在萎凋历时0h的相对表达量是最高的,是52h的6倍。(3)CsDAHPS基因的 cDNA 全长为 1935 bp,ORF 为 1812bp,编码560个氨基酸,与番茄、番薯紫竹、可可的同源性均为100%;荧光定量PCR结果表明,萎凋历时0h至24h,CsDAHPS含量呈现缓慢下降的趋势,变化差异不大,在萎凋历时32h的相对表达量是最高的,是52h的5倍。4.以不同萎凋阶段的白茶萎凋叶为供试材料,分别采用福林酚(Folin-Ciocalten)比色法和高效液相色谱法(HPLC)测定了茶多酚、儿茶素组分含量的变化,并以实时荧光定量PCR检测白茶萎凋过程中与儿茶素物质代谢合成相关基因(PAL、C4H、CHS、CHI、F3’5’H、F3’H、F3H、DFR、LAR、ANS、ANR和UGGT)的相对表达量。白茶萎凋过程中茶多酚含量呈逐渐降低趋势,儿茶素组分中表儿茶素(EC)、没食子儿茶素(GC)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)含量整体上呈先上升后下降的变化趋势,且均在萎凋历时32h出现最大值。实时荧光定量PCR检测结果表明,儿茶素生物合成途径关键酶基因PAL、C4H、CHI、F3H、F3’H、F3’5’H、DFR、LAR、ANR和UGGT均在萎凋历时32 h呈上调表达,CHS基因则随萎凋历时的增加呈下调表达趋势,ANS基因表达在整个萎凋过程中呈先上升后下降的变化趋势,在萎凋历时16h达最大值。白茶萎凋过程中儿茶素合成途径关键基因表达水平具有调控儿茶素生物合成的作用。在白茶萎凋过程中,儿茶素生物合成途径关键酶基因PAL、C4H、F3H、F3’H、DFR、LAR、ANR的表达与儿茶素组分单体EC、GC、EGC的积累规律基本一致,其最大值均出现在萎凋历时32 h。
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