生物信息学是当前生物科学的研究热点之一，利用EST数据库电子克隆新基因的研究就是其中一项重要的内容。蜜蜂(Apis mellifera)是一种重要的农业昆虫，它不仅能生产蜂产品，而且还是农作物的重要授粉者。目前蜜蜂已成为一种模式生物。此外，蜜蜂的社会性特性和行为特点也引起了生物学家的强烈兴趣。但是，目前发现的蜜蜂基因数量很少。所以，在蜜蜂基因组计划(Honey Bee Genome Project, HBGP)完成的基础上，利用蜜蜂EST数据库信息电子克隆蜜蜂新基因的研究工作就有一定的现实意义。 本文以果蝇(Drosophila melanogaster)基因cDNA序列为信息探针，对蜜蜂EST数据库进行同源检索筛选，电子克隆蜜蜂相关基因，并预测其功能，旨在根据物种间同源基因序列，建立一条跨物种电子克隆新基因的有效途径。研究结果如下： 1 蜜蜂腺苷酸转移载体基因的克隆与分析 以果蝇腺苷酸转移载体基因(ant)cDNA序列为信息探针，对蜜蜂EST数据库进行同源检索筛选，克隆了蜜蜂腺苷酸转移载体基因的cDNA序列(GenBank登录号为AY332626)，基因全长1251bp。通过NCBI的ORF finder服务器对所获得的cDNA序列进行开放阅读框架(ORF)分析，结果发现其开放阅读框架位于第29～931位，推测编码300个氨基酸。ORF前有多个终止密码子，后有加尾信号TTTATT。通过不同物种间同源基因的比较发现，该基因推测编码的蛋白质结构完整，说明所获得的cDNA序列为实际的功能基因，其包含的ORF是完整的。为了验证电子克隆序列的正确性，在其起始密码子区域和终止密码区域设计特异引物，经RT-PCR进行克隆、序列分析验证，结果表明与电子克隆序列完全一致。 通过比对发现，在核酸水平上蜜蜂ant与果蝇、家蚕(Bombyx mori)、烟草天蛾(Manduca sexta)、按蚊(Anopheles gambiae)、绿蝇(Lucilia cuprina)等几种昆虫ant的cDNA序列有着较高的一致性，分别为76％、72％、71％、70％和75％。 通过设计特异引物，克隆到全长为5774bp的蜜蜂ant基因组序列(GenBank登录号为AY568009)。一刘用Gon。Finde:软件分析发现，蜜蜂‘二l告因组序列内有3个内含子，分别位于第!717一3078位、第3341一3442位和第3678一3760位，且剪切位置均符合“G下AG法则”，大小分别为1 36北p、IOZbp和83bP;4个外显子分别位于第1 525一1 716位、第3 079一3 34()位、第3 443一3 677位和第3762一4322位，大小分别为192bp、261bp、235bp和 562bp，其oRF横跨全部4个外显子。分析蜜蜂ant基因ORF上游1 553bp基因组DNA序列的启动子区域，结果发现存在2个启动子，分别位于第1076一1126位和第1242一1292位，可能性分别为0.87和0.%。共存在9个典型的TA工入一box;在146位有CA户a’- box。 分析蜜蜂ant基因推测编码300个氨基酸的蛋白质发现，其相对分子量为32.987 kDa，理论等电点PI钓.71。大约在该蛋白质的第1 14一136位、第174一1%位和第21卜233位分别存在一个疏水区。经TMHMM一2，O软件分析，有3个跨膜区，分别位于第114一136位、第174一196位和第211一233位:软件Signalp一2.0分析，该蛋白质序列的信号肤位于第22位。 分析蜜蜂ant基因推测编码蛋白质的同源性，可以看出该蛋白质与NCBIGenBank中的大量物种的腺普酸转移载体蛋白(ANT)有着相当高的同源性;该蛋白序列与目前已知的蛋白质结构功能域数据库中许多蛋白质具有相似的结构功能域，分析其保守功能域，结果发现该蛋白质具有3个线粒体穿膜结构域，分别位于第9一107位、第114一210位、第211一300位。 将蜜蜂ant基因推测编码蛋白质与果蝇、家蚕、烟草天蛾、按蚊、绿蝇等昆虫ANT进行比较发现，序列的一致性分别为81%、81%、83%、75%和82%;同源性分别为86%、89%、90%、83%和87%。说明该蛋白质与其他昆虫的ANT的确存在着显著的相似性，而且在功能上也类似。根据核酸和蛋白序列多重对齐的结果绘制分子进化树基本上代表了它们在经典分类上的地位。 根据上述分析结果，初步预测蜜蜂ant基因推测编码的蛋白质和其他物种的腺普酸转移载体蛋白具有相同的功能，负责线粒体内膜上ATP与ADP的运输，命名为蜜蜂腺普酸转移载体(ANT)，NCBI GenBank登录号为AAQ24500。因而，说明蜜蜂a)ll基因是蜜蜂生命活动的关健基因。2蜜蜂H十一ATP合成酶16山a蛋白脂质C亚基基因的克隆与分析 以果蝇ATP合成酶16kDa蛋白脂质c亚巷尽因(、，爪，/引cDNA序列为信息探针，BLAST检索GenBank的蜜蜂EST欲据库，拼接有部分同源的EST序歹!J，获得58lbp的蜜蜂vha/‘基因的eDNA全序歹‘j(GenBank登录号为AY343324)。Rl飞PCR验证结果与电子克隆序列完全一致。 用所设计的特异引物克隆获得该基因长为2 968bp的部分基因组序列。对该序列分析发现，在其第1一133位、第1 965一2 154位和第2 711一2968位分别为外显子;2个内含子分别位于第134一1%4位和第2 155一2 710位，且内含子的剪切位置均符合GT-AG规则。 分析蜜蜂vhal百基因。DNA全序列，发现仅有一个0盯，起始密码子在第59位，终止密码子在第527位，推测编码156个氨基酸，预测其理论相对分子量为15.97 kDa，理论等电点川=6.7