论文部分内容阅读
抗菌多肽应用于医学、植物病虫害的防治研究一直受到人们的重视,从微生物中发现的抗真菌、细菌的多肽已有一些被应用于治疗人类、动植物的疾病,并可作为生物表面活性剂、食品防腐剂和饲料添加剂。本研究分离筛选到一株对真菌和细菌具有广谱抗菌作用的CP7菌株,对该菌株进行了分类鉴定,研究了该菌发酵粗提液的特性和杀菌机理,对其抗菌物质进行了分离纯化,结果如下:
1.用传统的细菌分类鉴定法和分子生物学鉴定法对CP7菌进行种的鉴定,通过形态特征观察、生理生化特性的检测以及16SrDNA序列的聚类分析,确定了CP7菌株是属于多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)。菌种已于2005年送交中国典型培养物保藏中心保存(武汉,保藏编号为:CCTCCNO:M205119)。16SrDNA序列已在GenBank数据库上登录,注册号为AY772704。
2.对CP7菌株的生长特性进行了研究,检测到该菌在30℃、发酵培养到36h-48h之间,其发酵液的抑菌活性最高,此时最适宜从发酵培养液中提取抗菌活性物质。
3.用均匀试验设计筛选出适合CP7菌株发酵培养、能高效产抗菌物质的最佳发酵培养基配方组成是:麸3.83g,粉A3.9g,MgSO4·7H2O0.105g,K2HPO4·3H2O0.17g,蒸馏水50mL。
4.CP7菌的抗菌物质粗提液,对热稳定,100℃水浴处理30min,抗菌活性保持100%。在酸性条件下稳定,但在强碱条件则会稍微降低其抗菌活性。氯仿、蛋白酶K、胰蛋白酶对其抑菌活性略有影响。60Coγ-射线辐照不影响其抗菌活性。粗提液能在低温条件下长期保存,在4℃的冰箱存放10个月,其相对抑菌活性保持在90.08%;室温下(30℃左右)放置16天,其相对抑菌活性仍达到84.4%。
5.测定CP7菌抗菌物质对真菌和细菌的抗菌活性,抗菌物质粗提液对5种革兰氏阴性菌(大肠杆菌K12D31、大肠杆菌标准株[CMCC44102]、大肠杆菌DH5α、荧光假单孢菌、灵菌)和6种革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌[CMCC26003]、枯草杆菌、杀螟杆菌、苏云金杆菌、葡萄球菌、黑胸败血菌)均有一定的抑制作用;对5种家蚕病原真菌(褐僵菌、绿僵菌、白僵菌、黄僵菌、黄曲霉)、4种果蔬类病原真菌(荔枝炭疽病菌、荔枝霜疫霉菌、灰葡萄孢菌、瓜类炭疽病菌)和3种植物病原真菌(褐色杆枯菌、玉米大斑病菌、纹枯菌)也表现出抑制孢子萌发和菌丝生长的作用。此外,粗提液对青霉菌和白色念珠菌也有一定的活性作用,但对毕赤酵母和卡尔斯伯酵母却没有抑制作用。
6.通过光学显微镜、扫描电镜和透射电镜观察,抗菌物质粗提液作用荔枝霜疫霉菌(真菌)后,孢子不能发芽;菌丝体肿胀、变形、不生长,原生质体凝集,细胞内形成很多空白区域、部分细胞器溶解。经粗提液处理后的大肠杆菌标准株,在细胞外围可见许多短线状的絮状物,细胞器、细胞核完全消失,推测是在细胞周围形成了离子通道,引起胞内物质外泄;苏云金杆菌被粗提液处理后细胞膜局部破损,在某些部位有大颗粒状物质流出,推测是在细胞膜上形成孔洞,使内容物泄露;其芽孢经处理后,外壳层发生了显著变形。
7.从CP7菌的发酵液中提取抗菌物质,通过固相萃取(Sep-PakCartridges)、阳离子交换层析(CMSepharoseFastFlow)、SephadexG-50凝胶过滤层析和SephasilpeptideC18柱反相层析,分离、纯化获得4个抗菌活性组分B1、B2、C1、C2。经质谱分析,测得它们的分子量分别为1155.703Da、1185.801Da、1169.822Da、1191.923Da。其中C1的分子量与已报道的PolymyxinE1、PolymyxinE7和PolymyxinIle-E1的分子量相同;进一步经圆二色谱测定显示,C1组分是100%的无规则结构,无α-螺旋、也无β-折叠和无转角结构;红外光谱分析表明C1含有羧基、氨基和酰胺基团;MALDI-TOF-TOF-MS质谱测定,C1的结构与PolymyxinE1相同。B1的分子量与已报道的PolymyxinE2、PolymyxinE3、PolymyxinIle-E2和PolymyxinVal-E1的分子量相同。B2和C2组分,在多粘菌素(Polymyxin)的研究中,未见与其分子量相同的报道。
8.用含地衣多糖的LB平板检测到CP7菌株及其发酵液具有β-1,3-1,4-葡聚糖酶活性。根据已报道的葡聚糖酶基因序列设计引物,经PCR扩增获得一特异DNA片段,并对其进行了克隆,该片段长度为638bp,共编码211个氨基酸。通过同源性比较得知,该片段与葡聚糖酶基因97%同源,所编码氨基酸完全一致。