【摘 要】
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目的:本研究旨在探讨miR-21在EGF诱导的胰腺癌细胞增殖中的作用及其调控机制;检测miR-21和Spry2在胰腺癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系。方法:利用qRT-PCR检测miR-21在6种胰腺癌细胞和永生化胰腺导管上皮细胞内的表达量。q RT-PCR检测miR-21在不同的EGF浓度梯度和时间梯度下的表达量。在EGF刺激下,分别上下调miR-21表达,利用CCK-8和Ed U实验检测
【基金项目】
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国家自然基金面上项目（81572316）； 上海市科委项目（14411966900）； 上海交大医工交叉项目（YG2014MS24）；
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目的:本研究旨在探讨miR-21在EGF诱导的胰腺癌细胞增殖中的作用及其调控机制;检测miR-21和Spry2在胰腺癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系。方法:利用qRT-PCR检测miR-21在6种胰腺癌细胞和永生化胰腺导管上皮细胞内的表达量。q RT-PCR检测miR-21在不同的EGF浓度梯度和时间梯度下的表达量。在EGF刺激下,分别上下调miR-21表达,利用CCK-8和Ed U实验检测细胞的增殖能力,利用流式细胞学技术检测细胞周期、细胞凋亡,应用Western blot技术检测细胞增殖（Ki67,PCNA）、细胞凋亡（Bax,Bcl-2）、细胞周期（Cyclin D1）等相关蛋白的表达以及信号通路相关蛋白的变化。以含有firefly luciferase标记基因的慢病毒载体构建miR-21过表达及敲低的稳转株,构建裸鼠皮下成瘤模型,利用小动物活体成像技术检测各组裸鼠体内瘤体大小。荧光素酶报告基因实验检测miR-21对Spry2的调控作用,q RT-PCR和Western blot技术分别检测miR-21上下调后Spry2 m RNA和蛋白的表达。分别上下调Spry2的表达,利用CCK-8和Ed U实验检测细胞增殖能力,流式细胞学技术检测细胞周期、细胞凋亡。应用Western blot技术检测信号通路相关蛋白的变化。采用ISH、IHC技术检测胰腺癌患者癌和癌旁正常组织miR-21、Spry2的表达。结果:1、qRT-PCR结果显示miR-21在胰腺癌细胞中的表达显著增高;EGF刺激能增加miR-21的表达量。2、上调PANC-1细胞中miR-21的表达,细胞增殖能力增强,细胞周期由G1期向S期转化,细胞凋亡比例下降,同时,Ki67、PCNA、Cyclin D-1、Bcl-2表达量升高,Bax表达量降低;下调MIA Pa Ca-2细胞中miR-21的表达,细胞生长增殖能力降低,细胞周期G1期捕获,细胞凋亡比例显著增加,Ki67、PCNA、Cyclin D-1、Bcl-2表达量下降,Bax表达量增高。3、miR-21上调,裸鼠皮下移植瘤增长能力增强,miR-21下调后,裸鼠皮下移植瘤增长能力下降。4、miR-21上调,ERK1/2和AKT的磷酸化水平增强,而miR-21敲低后,ERK1/2和AKT的磷酸化水平明显被抑制。5、上调PANC-1细胞中miR-21的表达,Spry2m RNA和蛋白水平降低,下调MIA Pa Ca-2细胞中miR-21的表达,Spry2 m RNA和蛋白水平升高;双荧光素酶报告实验表明上调miR-21表达可抑制含Spry2序列质粒的荧光素酶活性,下调miR-21表达可增强含Spry2序列质粒的荧光素酶活性,进一步证明了miR-21能够直接与Spry2 m RNA 3’-UTR（untranslated region）区结合,进而抑制Spry2表达。6、在MIA Pa Ca-2细胞中上调Spry2表达,细胞生长增殖能力降低,细胞周期G1期捕获,细胞凋亡比例增加;在PANC-1细胞中下调Spry2表达,细胞生长增殖能力增强,细胞周期由G1期向S期转化,细胞凋亡比例降低。7、Spry2上调,ERK1/2和AKT的磷酸化水平明显被抑制;Spry2下调,ERK1/2和AKT的磷酸化水平增强。8、ISH、IHC实验结果表明,miR-21与Spry2表达量存在负相关;miR-21表达在胰腺癌组织中均显著高于对应癌旁正常组织,且与肿瘤T分期、N分期和UICC（Union for International Cancer Control）分期呈正相关,高表达miR-21胰腺癌患者总生存期（OS,Overall survival）显著低于低表达miR-21胰腺癌患者;Spry2表达在胰腺癌组织中均低于对应癌旁正常组织,且与肿瘤分级、T分期、N分期和UICC分期呈负相关,高表达Spry2胰腺癌患者总生存期明显高于低表达Spry2胰腺癌患者。结论:EGF促进miR-21的表达量,miR-21通过抑制Spry2表达,增强EGF下游信号通路MAPK/ERK和PI3K/AKT的活性,进而促进EGF诱导的胰腺癌细胞增殖,促进细胞周期进程,抑制细胞凋亡。这一调控机制不仅为揭示胰腺癌细胞的增殖机制提供新的研究方向,亦可为胰腺癌的诊治和预后提供新的分子靶标,具有重要的理论意义和临床应用价值。
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