筛选中药中活性成分的传统方法一般先对中药不同极性部位进行分离,再结合相应的药理试验筛选特定的有效成分。但中药成分复杂,受产地品种因素影响大,造成筛选时间长,且筛选效率低等缺点。与传统方法相比,生物膜亲和色谱技术具有特异性识别等特性。生物膜亲和色谱法主要将富含受体、转运蛋白或其他分子的生物膜（如细胞膜等）固定在某一载体上,应用于中药活性成分的筛选及药物分子间作用等研究,具有专一性高、操作过程简单快捷等优点。目前,作为一种分离、分析和纯化的有效方法,其在天然药物中的有效成分筛选与纯化、药物-受体间相互作用机制研究及质量监控等领域的研究已成为热点。在此基础上,本实验室发展了脂筏亲和色谱技术,其色谱柱将脂筏包裹到活化硅胶表面,制成亲和固定相,利用药物与脂筏受体之间的特异性亲和力等特性来研究流动相中药物与受体相互作用的规律。其缺点在于由于硅胶小球表面特性,脂筏覆盖在硅胶小球表面易引起粘黏,渗透性差,长期使用带来柱压升高等一系列问题。本文在前期工作的基础上,尝试将脂筏采用静态吸附法包裹到有机-无机杂化整体柱实验上,利用整体柱的孔径大,孔径均匀,比表面积大等特点制备新型脂筏整体柱。首先使用去垢剂法及蔗糖梯度法对U251细胞脂筏进行提取分离并表征,然后以5μm硅胶小球为固定相,构建富含TrkA靶点的U251脂筏氨基硅胶柱色谱筛选模型并验证其可行性;在此基础上,进行不同类型整体柱的制备及优化,确定以“一锅法”制备的有机-无机杂化整体柱作为基质;采用western blot等表征摸索出脂筏整体柱的制备条件;用固相萃取法考察脂筏整体柱筛选TrkA靶点药物,其中,阳性药物吉非替尼,阴性药物吉西他滨、5-氟尿嘧啶。本文成功构建了脂筏杂化整体柱亲和模型并对TrkA底物或抑制剂的活性部位进行初步的尝试,为脂筏色谱固定相研究及药物筛选提供新思路。第一章综述本章主要对生物膜亲和色谱和整体柱的发展进行概述。首先对拟生物膜色谱,细胞膜色谱,脂筏色谱的机制及其研究进展进行概括,并归纳了脂筏上的特殊靶点及其相关作用;阐述了亲和色谱固定相的作用及影响;最后总结了不同种类的整体柱的特性,制备方法及应用,为脂筏整体柱色谱模型的构建进行了前期文献调研。第二章脂筏氨基硅胶填充柱色谱模型的构建本章在前期工作基础上,优化了U251细胞脂筏的提取方法,选用以氨基修饰的硅胶小球作为固定相的脂筏氨基硅胶填充柱色谱模型。首先培养及扩增U251细胞,采用传统去垢剂法及蔗糖密度梯度法提取分离富含TrkA靶点的脂筏。通过western blot和免疫荧光法对脂筏中的特征蛋白进行表征证明脂筏的生物活性。将脂筏包裹到5μm氨基修饰的硅胶小球作为色谱柱的固定相,制备脂筏氨基硅胶填充柱色谱模型。然后以阳性药吉非替尼及阴性药吉西他滨、5-氟尿嘧啶来考察脂筏色谱的保留特性。结果证明,构建的富含TrkA靶点的脂筏氨基硅胶柱色谱模型可对TrkA抑制剂有明显保留。本章成功构建了U251脂筏氨基硅胶柱筛选模型,为研究脂筏整体柱模型奠定基础。第三章无机整体柱的制备及其脂筏修饰的条件摸索本章采用溶胶-凝胶法制备无机整体柱,将提取的脂筏以静态吸附法包裹到无机整体柱表面,再用吉非替尼药物对无机整体柱进行分析。通过单因素实验优化无机硅胶整体柱的最佳制备条件;通过western blot及免疫荧光实验进行脂筏与无机整体柱的初步评价,实验结果表明,无机整体柱能够与脂筏蛋白较好包裹;采用单因素实验对无机整体柱的制备条件进行优化,得到最佳的工艺条件。液相色谱初步评价结果表明,脂筏无机整体柱的柱压比硅胶填充柱低,但重现性较差,难以在线筛选。本章实验证明了实验前期构建的脂筏整体柱色谱模型构建的可行性,也为整体柱基质的选择打下基础。第四章杂化硅胶整体柱的制备及表征本章采用“一锅法”制备有机-无机杂化整体柱,通过单因素实验对杂化整体柱的制备条件进行优化,再以扫描电镜,红外光谱等方法确定杂化整体柱的最优制备条件,用于后续脂筏杂化整体柱的研究。单因素实验表征结果表明,最优制备工艺制备的杂化整体柱交联性正常,孔径适宜,硬度适中。第五章脂筏杂化整体柱的制备及表征本章在前期成功构建的杂化整体柱的基础上,利用静态吸附法将脂筏包裹到整体柱上,通过western blot等试验确定脂筏包裹整体柱的量,完成脂筏杂化整体柱的制备;采用western blot法确定脂筏杂化整体柱的最佳制备条件,再以扫描电镜,BET比表面积法表征脂筏杂化整体柱,表征结果证明脂筏能够被较好被包裹在杂化整体柱上。第六章脂筏杂化整体柱的初步应用本章将制备好的脂筏杂化整体柱采用固相萃取法对阳性药物吉非替尼及阴性药物吉西他滨,5-氟尿嘧啶进行初步尝试,将洗脱液进行HPLC测定,色谱结果证明脂筏杂化整体柱能够对吉非替尼有保留,对吉西他滨,5-氟尿嘧啶无保留行为,说明构建好的脂筏杂化整体柱可应用于活性成分的筛选,为脂筏固定相的后续发展提供了新思路。