腹腔感染导致的脓毒症至今仍是危及生命的难题,有着极高的发病率和死亡率。肠瘘导致的腹腔感染是脓毒症的主要原因之一。基于液体复苏、感染源控制和抗生素的传统疗法并不能有效地改善脓毒症病人的预后。发生脓毒症时,肝脏是仅次于肺脏,排列第二位的最容易损伤的器官。在脓毒症的早期,病人即发生高胆红素血症。在肝细胞的胆管面和血窦面有多种转运蛋白。血红蛋白的降解产物形成非结合胆红素,在肝细胞内,它转化为结合胆红素,通过肝细胞的胆小管面分泌到胆汁中,或通过肝细胞的血窦面分泌到血液中。肝脏血流低灌注可能导致缺血性肝炎,从而发生肝功能损伤。作为一种新开发的仪器,激光散斑对比成像仪受到了广泛关注。它可以持续、实时地监测脏器微循环的变化。NLRP3炎症小体(NOD-like receptor family,NLRP3)是一种胞浆内的复合体,剪切IL-1β和IL-18的前体,使它们成为成熟的的炎性因子。IL-1β和IL-18可损伤肝细胞上的转运蛋白。NLRP3炎症小体促进中性粒细胞在脏器中聚集。目前对脓毒症导致的高胆红素血症的机制尚不清楚,脓毒症各阶段的肝脏微循环的变化也未有报道。尚没有文献报道NLRP3炎症小体和脓毒症导致的高胆红素血症的相关性,及潜在的治疗价值。本课题首先通过临床实验,观察在腹腔感染导致的脓毒症病人中,发生高胆红素血症与预后的相关性。接下来,通过大鼠的腹腔感染模型,使用激光散斑对比成像仪,深入研究脓毒症时肝脏微循环血流的动态改变。最后,我们评价了使用短发夹RNA质粒,基因缄默NLRP3炎症小体,对脓毒症导致的高胆红素血症的疗效,为下一步的临床实验提供理论依据。全文共分为如下三部分:第一部分:血清直接胆红素浓度预测肠瘘合并腹腔感染病人的预后目的:本实验的目的是评价持续监测血清直接胆红素的浓度,是否可以预测肠瘘合并腹腔感染病人的预后。方法:这是一项前瞻性的观察实验,纳入2012年1月1日至2013年1月13日收入南京军区南京总医院普通外科的肠瘘合并腹腔感染病人162例,作为推导队列。根据这些病人的28天死亡情况,分为生存组(n=119)和死亡组(n=43)。监测病人入院当天及入院第3、7天的各项生化指标。DB0的定义是入院当天的血清直接胆红素浓度,△DB3的定义是入院第3天的血清直接胆红素浓度与入院当天的血清直接胆红素浓度的差值。该定义也适用于其他指标。使用ROC曲线分析各生化指标预测病人预后的敏感度和特异度。同时,纳入2013年1月14日至2013年10月16日收入我科的116例病人作为验证队列,再次检验从推导队列鉴别出的有价值的预测指标。结果:与生存组相比,死亡组病人的DB7显著升高(23.1±10.6 vs.11.2±1.1,P<0.001),第7天的降钙素原浓度PCT7也显著升高(5.2±2.8 vs.1.7±0.3 P=0.006)。ROC曲线分析表明,DB7>12.8 μmol/L或ΔDB7>7.3 μmol/L可准确地预测病人的28天死亡情况(DB7:敏感度86.4%,特异度88.6%,(ROC曲线下面积AUC):0.881,P<0.001;ΔDB7:敏感度 84.4%,特异度 85.1%,AUC:0.865,P<0.001)。联合多个指标预测的准确度最高:(DB7>12.8 μmol/L+ΔPCT7<5.3 ng/m)(AUC:0.894,P<0.001)。这些指标的预测价值在验证队列中再次被证实。结论:持续监测血清直接胆红素的浓度,可预测肠瘘合并腹腔感染病人的28天死亡情况,直接胆红素升高和胆红素浓度波动幅度过大是敏感的预警指标,应该在危重症病人的临床监护中加以重视。第二部分:激光散斑对比成像仪监测脓毒症时的肝脏微循环目的:脓毒症是一种由严重感染导致的致命的系统性炎症反应。本实验的目的是使用激光散斑对比成像仪(Laser speckle contrast imaging,LSCI),监测脓毒症时肝脏的微循环变化,同时研究导致肝脏微循环障碍的机制。方法:使用盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)的方法制作大鼠的脓毒症模型。大鼠被分为假手术组和脓毒症组,使用激光散斑对比成像仪监测实验过程中大鼠的肝脏的微循环变化。同时,比较这两组大鼠的肝脏内皮细胞功能(细胞间粘附分子的含量、凝血功能和血管通透性),肝脏中的中性粒细胞聚集情况等。结果:脓毒症时,肝脏的微循环障碍逐渐加重(初始时290.3±70.1 LSPU(激光散斑对比成像仪测得的血流灌注单位)vs.脓毒症后12小时:230.4 ± 60.7 LSPU vs.脓毒症后48小时:125.2±25.4 LSPU,P<0.001)。脓毒症发生后6小时,大鼠发生高胆红素血症。在脓毒症的早期,肝脏中的中性粒细胞聚集不断增加,血管内的微血栓阻塞情况也越来越严重。在脓毒症的晚期,肝脏中的中性粒细胞聚集已达到峰值。同时,内皮细胞的凝血功能从促凝状态转为抗凝状态。脓毒症后12h,肝脏血管通透性增加,也是肝脏微循环功能的障碍的发生原因之一。结论:脓毒症的早期,就发生了肝脏微循环障碍,导致了肝功能损伤。肝脏微循环障碍的原因包括中性粒细胞和内皮细胞的相互作用,血窦内微血栓的形成和肝脏血管通透性的增加。第三部分:基因缄默NLRP3炎症小体治疗脓毒症导致的高胆红素血症和高胆酸血症目的:NOD样受体家族(NLRP3)炎症小体在很多炎症疾病中起到重要的作用。但NLRP3炎症小体和脓毒症导致的高胆酸血症和高胆红素血症的关系尚不明确。我们的目的是验证,通过基因缄默NLRP3炎症小体是否可以治疗脓毒症导致的高胆酸血症和高胆红素血症。方法:使用盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)的方法制作大鼠的脓毒症模型。在术前48小时,通过尾静脉注射NLRP3的短发夹RNA质粒(NLRP3 shRNA,NLRP3 short hairpin RNA plasmids)。大鼠被分为 4 组,组 1:假手术组;组2:脓毒症组;组3:注射NLRP3的短发夹RNA质粒后再造模脓毒症组(在本文中被称为“NLRP3的短发夹RNA质粒组”;组4:注射无意义序列的短发夹RNA质粒后再造模脓毒症组(在本文中被称为“无意义序列的短发夹RNA质粒组”)。设置术后0小时、6小时、12小时、24小时和48小时为取材的时间点,共5个时间点,在各个时间点测定大鼠血清中的胆酸浓度和胆红素浓度,肝脏中的肝细胞表面转运蛋白的mRNA水平和蛋白水平,肝脏中的炎性细胞因子的含量和各种炎性细胞的特性,并比较各个组的变化情况。结果:脓毒症后,肝脏中NLRP3的mRNA水平和蛋白水平都显著上升,但使用NLRP3的短发夹RNA质粒预治疗后,NLRP3的mRNA水平和蛋白水平的表达被抑制。和脓毒症组的大鼠以及无意义序列的短发夹RNA质粒组的大鼠相比,NLRP3的短发夹RNA质粒组的大鼠的血清中甘氨酸-结合胆酸的浓度显著下降,血清中牛磺酸-结合胆酸的浓度显著下降,血清中结合胆红素的浓度也显著下降。肝细胞的转运蛋白的表达水平得以恢复,肝脏中的炎性细胞因子的浓度下降,肝脏中聚集的中性粒细胞数量减少,巨噬细胞发生炎性凋亡的比例减少。结论:基因缄默NLRP3炎症小体可治疗脓毒症导致的高胆酸血症和高胆红素血症,治疗的机制是通过恢复肝细胞的转运蛋白的表达水平,减少肝脏中的炎性细胞因子的浓度、肝脏中聚集的中性粒细胞数量和巨噬细胞发生炎性凋亡的比例。NLRP3炎症小体可能是治疗脓毒症的一个重要靶点。