黄曲霉毒素M1(aflatoxin M1,AFM1)是牛奶中唯一具有最大残留限量的霉菌毒素。赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)不仅常在牛奶中检出,也是谷物类食品和饲料的主要污染源之一。近年来,“牛奶+谷物(面包)”已逐步成为常见的家庭膳食模式,使得AFM1与OTA在人体内共存并产生联合作用的潜在风险也随之增加。肠道是机体抵御外来污染物入侵的第一道屏障。因此,研究混合AFM1和OTA对肠道屏障损伤作用具有重要意义。1.单独及混合的AFM1(0.12和12μM)和OTA(0.2和20μM)降低紧密连接(tight junction,TJ)蛋白的表达量、改变其细胞膜定位,破坏肠上皮细胞层完整性,使肠上皮通透性增加,混合AFM1和OTA之间存在着加和及协同作用。抑制剂干扰实验表明,霉菌毒素诱导的肠屏障损伤与p44/42丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路相关。2.利用转录组-蛋白组联合组学分析阐明12μM的AFM1和9.9μM的OTA两种霉菌毒素在破坏肠道完整性方面具有协同作用,该协同作用与混合处理组中下调的基因和蛋白质富集到的与肠道完整性相关途径有关,包括粘着斑、粘连连接和间隙连接途径。对蛋白激酶C-α(protein kinase C,PKC-α)进行基因干扰实验,结果发现,PKC-α对于维持分化Caco-2细胞层的完整性具有重要意义。3.研究结果表明,混合12μM AFM1和9.9μM OTA在诱导炎症反应中表现为协同效应。转录组-蛋白组联合组学分析确定了3种潜在的作用机制:(i)与单独使用霉菌毒素处理组相比,混合霉菌毒素处理组诱导参与免疫相关途径的蛋白质发生更加明显的变化;(ii)相比于单独毒素,混合毒素靶向相同途径中的不同位点;(iii)相比于单独毒素,混合毒素激活了特定的炎症相关途径。4.本试验建立了单独AFM1、OTA(3.5 mg/kg b.w.)和混合AFM1+OTA(3.5 mg/kg b.w.+3.5 mg/kg b.w.)35天连续灌胃的ICR小鼠模型。霉菌毒素处理后,小鼠肠道内炎性细胞数目增多,杯状细胞数目降低,细胞间TJ蛋白定位改变,影响肠道健康的致病菌瘤胃球菌科、肠杆菌科和梭菌属丰度增加,保护肠道健康的益生菌乳酸菌属和拟普雷沃菌属丰度降低,表明小鼠肠道物理、化学、免疫及生物屏障受到损伤。综上,本研究以AFM1和OTA联合作用的危害评估为主线,以肠道屏障为研究目标,构建体外细胞和体内小鼠相结合的实验模型,发现AFM1和OTA联合作用增加对肠道毒性,并采用联合组学技术分析潜在的分子作用机制,筛选到霉菌毒素损伤肠道屏障相关的作用途径及靶蛋白。本研究结果对于建立多种霉菌毒素交互作用的风险评估方法、系统解析多种霉菌毒素交互作用对健康的危害具有重要的科学和实践意义。