一、目的与意义乳腺癌是起源于乳腺腺上皮组织的一种恶性肿瘤。据2015年肿瘤登记年报显示乳腺癌发病率位于肿瘤发病率的第六位,位居女性肿瘤发病率首位,死亡率并呈上升趋势,严重威胁到女性健康。乳腺癌的发病机制涉及激素水平、血管过度增生、蛋白质糖基化异常、基因突变等各种原因。蛋白质糖基化异常在肿瘤的发生发展过程中起很重要的作用,与肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭、转移等密切相关。蛋白质的糖基化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰,包括岩藻糖基化、唾液酸化和半乳糖基化等形式。其中岩藻糖基化是蛋白糖基化的一种重要形式。研究表明:蛋白质岩藻糖基化水平异常与肿瘤的发生发展密切相关。蛋白质岩藻糖基化是蛋白翻译后的重要的修饰方式,主要是在特异的岩藻糖基转移酶的作用下,催化GDP-岩藻糖中的岩藻糖从GDP末端转移到糖链末端从而形成糖蛋白。岩藻糖基转移酶Ⅳ（Fucosyltransferase Ⅳ,FUT4）是岩藻糖基转移酶（fucosyltransferases,FUTs）家族的成员之一。FUT4是催化形成α1,3-糖苷键,并合成肿瘤糖抗原Lewis Y（LeY）的关键酶。FUT4是一个Ⅱ型单次跨膜酶蛋白,主要定位于高尔基体上,另外一部分还可以分布定位于膜上,并可分泌到胞浆中。已发现FUT4在多种肿瘤中异常表达,例如在结肠癌和胃癌。课题组前期研究表明:在乳腺癌细胞中过表达FUT4可以促进肿瘤细胞增殖,利用RNA干扰技术下调FUT4的表达,可以促进肿瘤细胞凋亡。目前临床常用的乳腺癌诊断标志物主要有CA153和CEA。CA153在乳腺癌早期诊断中灵敏度为10%,晚期为75%。CEA在多种肿瘤中高表达,也缺乏灵敏度和专一性。因此寻找新的、高灵敏度和高专一性的乳腺癌诊断标志物,对乳腺癌的诊断、治疗和治愈等都有重要的意义。我们通过组织学、血清学以及细胞学的研究,进一步探讨了 FUT4在乳腺中的表达,分析和比较了 FUT4与CA153和CEA的灵敏度和专一性。研究结果提示:FUT4可能作为乳腺癌诊断的标志物。微量元素铜、锌和镁对维持细胞的正常生理功能起重要的作用。研究表明:铜、锌和镁是构成酶和蛋白质的辅助因子,并影响其结构和功能,参与蛋白质、核酸、糖、脂肪等生物大分子代谢,参与机体的氧化应激和肿瘤发生等。肿瘤的发生发展过程中常伴随这些元素的变化,例如:在肺癌患者血清中,铜、锌和镁含量高于正常人血清含量;而喉癌患者血清中铜、锌和镁含量低于正常人血清水平。因此微量元素可以作为肿瘤诊断、评价治疗效果、监视复发和估计预后的重要参数。我们探究铜、锌和镁的变化及其对FUT4酶活性调控,为乳腺癌治疗提供新思路。人参作为一种名贵中草药,具有滋阴、补肾、强体等功效,并且能够抑制肿瘤生长和提高免疫力等作用。研究表明:Rg3可以诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭;逆转肿瘤的耐药性等,但Rg3通过抗氧化抑制肿瘤增殖的报道较少。为了进一步探讨Rg3抑制肿瘤增殖作用及其抗氧化机制,采用人参中提取的活性单体Rg3,分析了 Rg3及其衍生物抗肿瘤增殖能力和构效关系;初步探讨了 Rg3通过抗氧化作用下调FUT4表达抑制肿瘤增殖的机制。FUT4与乳腺癌增殖、转移和侵袭密切相关,Rg3抑制FUT4的表达。Rg3是否可以直接作用与FUT4活性中心尚未见报导。我们利用计算机模拟Rg3和FUT4分子对接情况,进一步探讨其分子作用机制。综上,本研究旨在通过分析FUT4在乳腺癌患者组织、血清以及乳腺癌细胞中表达水平,进一步确定FUT4在乳腺癌中的作用机制,证实FUT4可以作为乳腺癌诊断标志物。建立一种FUT4活性检测有效方法,为FUT4的临床检测应用奠定了基础;利用金属离子和Rg3,进一步分析影响FUT4表达及活性影响因素,探究Rg3抑制肿瘤增殖,调控FUT4的机制,并利用计算机模拟Rg3与FUT4对接结果,最终为乳腺癌治疗提供一种新的可行策略。二、实验方法1、乳腺癌患者的血清样品263例以及体检正常人血清样品160例。采用酶联免疫法（ELISA）测定血清中FUT4的含量,应用SPSS18.0统计软件进行数据分析,以P<0.05为显著性差异标准。利用电化学发光法（ECLIA）方法检测血清中CA153和CEA含量。利用原子火焰分光光度法测定血清样本中铜、锌和镁的含量。2、收集2011至2012年在大连医科大学附属二院病理科存档石蜡组标本且临床资料完整的乳腺癌患者60例。采用免疫组化法分析所有病理标本中FUT4的表达,应用SPSS18.0统计软件进行数据分析,以P<0.05为显著性差异标准。3、利用Western blot检测了乳腺癌血清和乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231中FUT4表达水平,通过细胞免疫荧光的方法检测不同转移能力的乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231中FUT4表达水平以及不同浓度的微量元素对FUT4的表达的影响。4、利用孔雀石绿-磷酸根反应体系,建立FUT4活性检测方法。5、利用细胞增殖实验（MTT）观察Rg3及其衍生物对乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-2331的增殖的影响;Western blot、细胞免疫荧光等分析了药物处理后FUT4表达的变化。6、利用罗丹明123,Losy tracker Red两种荧光染料分别观察了细胞线粒体膜电位和溶酶体的稳定性。7、利用 Phyre2、Chimera、MarvinSketch6.3.1、pymol、Ledock 等软件,模拟了 Rg3及其衍生物M1与FUT4相互作用,初步探究Rg3与FUT4相互作用。三、结果（一）FUT4作为乳腺癌诊断标志物的研究1、利用免疫组化分析发现乳腺癌组织中FUT4表达水平高于癌旁正常组织。2、Western blot检测乳腺癌患者血清样品中FUT4表达显著高于正常人血清样品,具有统计学意义（p<0.05）。3、RT-PCR、Western blot和细胞免疫荧光显示:高转移力的MDA-MB-231细胞中的FUT4基因和蛋白表达水平均高于低转移的MCF-7细胞。4、乳腺癌血清样品中FUT4,CA153和CEA含量高于正常人血清样品对照组,并通过相关性分析,FUT4表达与CA153表达具有一定的相关性（r= 0.234,p =0.042）。5、ROC分析结果显示:FUT4（AUC = 0.786）的灵敏度和专一性都相对高于CA153（AUC = 0.568）和 CEA（AUC = 0.435）。（二）乳腺癌血清中微量元素铜、锌和镁与FUT4活性相关性分析1、利用火焰原子分光光度法,结果显示乳腺癌患者血清样品中铜、锌和镁高于正常人血清样品,具有统计学意义（p<0.01）。2、建立了孔雀石绿-磷酸根法检测FUT4活性方法,利用该方法测定乳腺癌患者血清样品中FUT4活性高于正常人血清样品（p<0.05）。3、利用SPSS18.0,通过相关性分析结果显示镁与FUT4活性相关（r = 0.096,p = 0.032）。4、利用细胞增值实验和平板克隆形成实验观察到镁可以促进乳腺癌细胞MDA-MB-231 的生长。5、通过Western blot和细胞免疫荧光实验证明了镁可以上调FUT4的表达。（三）Rg3及其衍生物对乳腺癌生长抑制作用及通过抗氧化抑制FUT4表达的初步研究1、MTT实验比较Rg3及其衍生物抑制乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231增殖作用,结果显示:Rg3和M1的作用效果相对较好。分析探讨不同化学修饰对化合物的活性影响,结果提示:结构上的细微差异对其性质影响极大。2、Rg3作用于乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231,使线粒体膜电位上升,释放细胞色素C。3、Rg3对溶酶体稳定性与浓度相关,在一定浓度范围内Rg3降低细胞溶酶体稳定性。4、Rg3及抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）,可以抑制FUT4表达;（四）Rg3与FUT4相互作用的分子模拟初步探讨1、通过生物信息学查询,利用 Phyre2、Chimera、MarvinSketch6.3.1、pymol等软件构建了 Rg3与FUT4的3D分子模型,并优化了构象,利用Delock软件进行了分子模拟。2、通过能量比较,Rg3与FUT4结合体系能量较低,相互作用效果优于M1。3、通过分子间相互作用力分析,Rg3与FUT4对接分子间作用力较强相对稳定。四、结论（一）FUT4作为乳腺癌诊断标志物的研究1、FUT4在乳腺癌组织和血清中都呈高表达,并具有显著统计学差异。2、FUT4在高转移的MDA-MB-231细胞中的基因和蛋白表达水平均高于低转移的MCF-7细胞。3、FUT4与常用的乳腺癌诊断标志物CA153和CEA比较,具有较高的灵敏度和专一性,可以作为乳腺癌诊断的治疗的有效的、新的标志物。（二）乳腺癌血清中微量元素铜、锌和镁与FUT4相关性分析研究1、乳腺癌患者血清中微量元素Cu,Zn和Mg浓度以及FUT4活性具有显著高于正常人血清对照组;2、Mg与FUT4具有显著相关,在一定浓度范围内微量元素Mg可以促进乳腺癌细胞增殖,并且可以影响FUT4的活性表达;（三）Rg3及其衍生物对乳腺癌生长抑制作用及通过抗氧化抑制FUT4表达的初步研究1、Rg3和M1抑制乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231的增殖较其他衍生物强。衍生物官能团不同,性质差异较大。2、Rg3通过抗氧化影响乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231线粒体膜电位;破坏溶酶体稳定性,从而下调FUT4,抑制乳腺癌细胞生长。（四）Rg3与FUT4相互作用的分子模拟初步探讨通过对接分析结果显示Rg3可以与FUT4对接,体系能量低,分子间作用力强的复合物,从而降低FUT4活性。