背景:人类基因组的破译、多种疾病全基因组关联研究（genome wide association studies,GWAS）的开展以及疾病发生分子机制研究的深入使与疾病发生、发展、药物敏感性和预后等因素密切相关的基因变异（突变或多态）逐渐得以揭示,从而使人们对一些疾病的治疗开始步入针对特异性分子变异的分子靶向治疗时代。众所周知,恶性肿瘤的发生及演进常涉及多种基因变异,而每例恶性肿瘤的驱动基因变异又各不相同。因此,治疗肿瘤方式也从同病标准化同治发展为基于特异性基因变异的同病个体化异治或异病个体化同治的分子靶向个体化治疗。研究恶性肿瘤分子特征,寻找驱动性或激活性的分子变异,从而筛选一个或几个分子靶向药物作为治疗以及后备治疗用药物,对预防耐药性产生,制定合理治疗方案具有重要意义。EGFR tyrosine kinase inhibitor（EGFR-TKI）是目前疗效肯定,应用最多的肿瘤分子靶向治疗药物。它不但可用于治疗非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）,对NSCLC以外具有药物作用分子靶点的恶性肿瘤具有同样肯定的疗效。虽然国人NSCLC患者中能够被预测对EGFR-TKI敏感程度的人群比例较高,但仍有一半以上患者因缺乏特征性基因变异,对该药物的疗效无法预测。另外,一部分起初对EGFR-TKI敏感的患者也会发生获得性耐药。探讨NSCLC中与EGFR激活性突变相关的分子变化将可能有助于这些问题的解决。近来EGFR-TKI治疗NSCLC以外其他恶性肿瘤的疗效倍受人们关注。多家研究机构发现头颈部癌、胃癌、结直肠癌等恶性肿瘤也存在EGFR突变,且有该突变的肿瘤也对EGFR-TKI敏感。胶质瘤是最常见的中枢神经系统恶性肿瘤,目前尚无对其疗效确切的分子靶向药。胶质瘤较少发生转移,其典型的生物学特征是恶性增殖和复发,且该肿瘤的EGFR常因胞外区编码基因突变（点突变或第2-7外显子缺失突变）、基因异常扩增、蛋白过度表达等被异常激活,胶质瘤是否能用EGFR-TKI治疗值得探讨。分子靶向个体化治疗的关键是确定肿瘤细胞的分子靶点,而最常见的分子靶点类型是基因变异。因此,建立能够有效地检测出基因变异的技术平台是分子靶向个体化治疗得以实施的基础。鉴于肿瘤标本的特殊性,检测方法的灵敏度,特别是从混杂DNA样本检出未知变异能力显得尤为重要。High resolution melting analysis（HRMA）技术是近年发展起来的基因变异检测技术,该技术无需PCR后的电泳分离,也无需荧光标记探针,只需PCR后直接加热使双链DNA解离,通过DNA双链饱和荧光染料记录熔解曲线即可实现对整个PCR扩增片段中基因变异的检测或基因分型,具有检测灵敏、快速、闭管操作、成本低廉,且可以检测到未知和已知基因变异的优点。HRMA技术检测基因变异通过熔解曲线形状或位置（Tm值）的改变来实现,而熔解曲线形状或位置不仅受待测基因自身序列和长度、PCR扩增体系中化学因素影响,还受HRMA技术仪器平台硬件及软件等因素影响。前者可以通过实验设计加以控制,但来自仪器的影响往往难以避免。目前可用于HRMA技术的仪器众多,在检测样品方式和数量、熔解（melting）条件和时间、检测方式、荧光信号采集方式以及分析软件等诸多方面存在较大差异,这些差异是否会影响仪器的基因变异检测准确率目前尚不清楚。因此,比较分析这些检测平台各自的技术特点、建立相应的技术评价体系是能够合理选择检测平台的关键,同时也有助于发现影响HRMA基因变异检测准确率、敏感性的相关因素,使该技术得以不断完善,进而推动其临床应用步伐。快速检测是临床样品检测时必须解决的问题。对于HRMA技术,检测速度加快需要DNA熔解时升温速率增加,然而长期以来存在争议的问题是升温速率增加是否会导致熔解曲线分辨率降低,从而使检测准确率下降。因此,系统研究这些问题对HRMA技术的完善和临床推广应用具有重要意义。方法和结果:一、错配修复基因hMLHl在EGFR突变的非小细胞肺癌高表达及其临床意义收集NSCLC标本181例,应用HRMA方法检测EGFR第19、21外显子和KRAS基因第2外显子突变,应用免疫组织化学方法检测错配修复蛋白hMSH2、hMLH1和细胞增殖标志蛋白PCNA、Ki67表达。NSCLC 中,EGFR 和 KRAS 突变率分别为:36.5%和 5.5%;hMSH2、hMLH1、PCNA 和 Ki67 表达率分别为:59.6%、71.3%、88.4%和 61.9%。NSCLC中,hMLH1过表达和腺癌分别是独立与EGFR突变密切相关的因素（p=0.013,p<0.0005）。随着hMLHl表达增强,EGFR突变率显著增高（p<0.0005）。与无EGFR突变NSCLC相比,EGFR突变NSCLC的hMSH2、hMLH1和PCNA表达率都增高,但Ki67表达率显著下降（p=0.030）。二、BRAF过表达促进胶质瘤恶性增殖不依赖EGFR的激活用免疫组织化学方法检测82例石蜡包埋胶质瘤组织标本EGFR、KRAS、BRAF、PI3K、Ki67 和 phospho-EGFR 蛋白表达,以 phospho-EGFR 表达作为 EGFR活化标志。胶质瘤标本 82例中,EGFR、KRAS、BRAF、PI3K、Ki67 和 phospho-EGFR阳性表达率分别为 75.6%、63.8%、72.0%、68.1%、69.5%和 59.8%。EGFR 活化与非活化胶质瘤的临床病理特征无显著差别。EGFR表达与胶质瘤患者年龄正相关（r=0.270,p=0.014）,且与其活化状态显著相关（p=0.029）。在EGFR活化胶质瘤中,EGFR、BRAF及PI3K表达均与肿瘤恶性增殖相关,而在EGFR非活化胶质瘤中,仅BRAF表达与肿瘤恶性增殖显著相关。三、HRMA法在NSCLC患者胸水标本EGFR、KRAS基因突变检测中的应用应用HRMA法检测36例晚期NSCLC患者胸水KRAS基因第2外显子和EGFR基因第19、21外显子突变,并计算突变率。胸水标本36例中KRAS第2外显子突变2例（5.6%）,EGFR第19、21外显子突变共10例（27.8%）。前期应用HRMA方法检测181例肺癌组织标本,KRAS突变10例（5.5%）,EGFR第19、21外显子突变共66例（36.5%）。HRMA法检测胸水标本得到的KRAS突变率及EGFR突变率与同法检测肺癌组织标本比较均无显著差别（p=1.000 和 p=0.318）。四、常见9种HRMA仪器检测基因变异的技术评价用LCGreen Plus,PCR扩增CPS1基因涵盖同一单核苷酸变异（c.3405-29A>T）3个基因型（A/A,T/T和A/T）的4个不同长度基因片段,将扩增产物作为待检测靶基因片段,用9种HRMA仪器（10种HRMA检测平台）分别进行检测（部分仪器以仪器推荐条件和0.1℃/s升温速率两种条件检测）,应用仪器自带软件及公共软件分析检测结果,分别计算杂合子与纯合子的基因分型准确率。总体上,杂合子检出准确率为99.7%（n=2141）,而纯合子为70.3%（n=4441）。对纯合子检出准确率单一样品扫描仪器显著好于全盘扫描仪器（分别为78.1%和61.8%,p<0.0005）。51、100、272和547bp四个基因片段的纯合子检出准确率分别为72.2%、83.1%、59.8%和65.9%（p<0.0005）。慢升温速率仪器的纯合子检出准确率并无显著提高。Log（△Tm/TmSD）可以作为仪器的质量控制参数,预测仪器的纯合子检出性能（AUC=0.863,p<0.0005）。五、HRMA升温速度对检测准确率的影响将HR-1的升温速率分别调整为0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64℃/s。在各升温速率条件下分别检测4个不同长度DNA片段的3个基因型样品（基因片段与第四部分相同）,每一样品检测3次。以仪器检测温度与样品实际温度间的偏差校正原始数据,然后分析校正后熔解曲线。随着升温速率增大,所有样品熔解曲线均向右（高温方向）平移,片段<300bp杂合子和小片段（51和100bp）纯合子更容易检出。升温速率越慢,片段长度272bp的纯合子越容易检出。升温速率居中（0.8℃/s）时,片段长度547bp的杂合子最难检出,而该长度的纯合子片段最容易检出;升温速率增加或减小均会使杂合子更易检出而纯合子片段变的不容易检出。结论:错配修复基因hMLH1过表达可能成为NSCLC患者对EGFR-TK1敏感的新的分子标志。胶质瘤BRAF过表达不依赖于EGFR的活化,可能作为独立影响因素参与调节胶质瘤恶性增殖,应用针对EGFR、BRAF、PI3K多靶点的分子靶向药物治疗胶质瘤可能优于应用单一靶点的EGFR-TKI。HRMA方法可保持极高的杂合子检出准确率,仪器因素、被检测基因片段长度等因素对检出准确率影响较小;纯合子检出的准确率依据检测仪器、基因序列片段大小及基因变异类型的不同而有所不同。提高升温速率并不意味着降低HRMA方法基因变异检出的灵敏度。HRMA方法敏感、快速、操作简单、无污染,且能够实现对未知和已知突变的检测,适用于临床,尤其适用于主要以杂合性突变为主的肿瘤标本,包括肿瘤患者胸水的检测。如果待测基因片段较短,提高升温速率可以使基因变异检测变得更加快速、敏感。