系统性硬皮病(SSc)是一种病因及发病机制不明涉及多因素的自身免疫性结缔组织疾病。SSc病理改变较为复杂,以皮肤及内脏器官进行性纤维化及硬化萎缩、微血管障碍、细胞免疫及体液免疫功能异常为主要表现。T淋巴细胞在SSc的发生、发展过程中起关键性作用。目前许多学者认为SSc是在遗传易感性的基础上,因各种环境因素刺激激活了免疫系统的复杂机能,造成了SSc的发病。而根据有关的表观遗传学理论,由环境诱导从基因型演绎为表型的过程是通过表观遗传机制来实现的。DNA甲基化是被最早发现并研究最多的表观遗传调控机制之一。一般来说,基因启动子的DNA甲基化与基因沉默有着紧密而且直接的联系；而低甲基化则能够诱导某些基因的表达。研究表明T细胞DNA甲基化修饰的改变与自身免疫性疾病的发病息息相关。本课题组之前的研究结果揭示：SSc患者CD4+T细胞中整体基因组DNA甲基化水平明显降低,呈低甲基化状态；进一步研究发现DNA低甲基化是导致SSc患者CD4+T细胞CD40L、CD70等基因过度表达的主要因素,相关基因启动子区域低甲基化在该病的发生,发展中起到了非常重要的作用。然而,SSc患者CD4+T细胞DNA发生低甲基化的分子机制尚未阐明,深入探讨其低甲基化的原因,将对揭示该病的确切发病机制具有重要的意义。组蛋白修饰是另一种重要的表观遗传调控机制,是组蛋白翻译后修饰的精密调节。一般来说,组蛋白乙酰化可以导致染色质开放结构的形成,从而增强转录活性；相反的,组蛋白去乙酰化则抑制基因转录。研究发现组蛋白乙酰化和DNA甲基化是一个相互促进、协同、加强的过程。本课题组之前的研究表明SSc患者CD4+T细胞中存在整体基因组组蛋白H3乙酰化水平降低及相关的乙酰化／去乙酰化修饰酶的差异表达；然而,基因组整体组蛋白修饰与特定基因的组蛋白修饰状态可能存在不一致的情况。前期研究发现DNMTs抑制剂(5-azacytidine,5-azaC)、组蛋白去乙酰基酶(HDACs)抑制剂(trichostatin A,TSA)或5-azaC联合TSA能够显著增加正常人CD4+T细胞CD70mRNA表达和增加CD70启动子区H3乙酰化(H3ac)水平,且联合两药处理比各自单独处理增加更为明显,揭示DNA低甲基化和组蛋白乙酰化都能使CD70基因转录上调,并且起着相互协同的作用。那么,在SSc患者CD4+T细胞中CD70转录调控机制方面,除了TNFSF7启动子DNA低甲基化发挥作用外,组蛋白修饰是否也发挥作用呢?我们将进一步研究SSc患者CD4+T细胞TNFSF7启动子区域的H3ac水平。MicroRNA是近年来在真核生物中新发现的一类内源性的参与基因转录后水平调控的非编码小分子RNA。它长度约为21-25个核苷酸,通过与目的基因靶mRNA的3’-UTR碱基序列的不完全或者完全配对,从而导致目的基因翻译的抑制或者基因表达沉默。MicroRNA普遍存在于多细胞生物中,而且数量十分可观,约占整个基因组基因总数的2%左右。据报道30%以上的蛋白质编码基因的表达受microRNAs调控,在细胞生长发育、增殖、凋亡、炎症反应、肿瘤形成及自身免疫反应方面等病理生理过程中发挥重要作用,属于调节因子家族中数量最为丰富的一族。MicroRNA调控是表观遗传学修饰的常见机制之一。MicroRNA芯片是高通量检测microRNA表达情况的最佳选择,它可以在短时间内同时鉴定所有已知的microRNA的表达。而SSc疾病中CD4+T细胞microRNA差异表达谱的情况至今未明,因此本研究第三部分MicroRNA芯片对SSc患者CD4+T细胞中差异表达的microRNA进行筛选及进一步PCR验证及靶基因预测。因此,本课题将通过三部分从DNA甲基化、组蛋白乙酰化、和microRNA调控三个层次来研究SSc患者CD4+T细胞中异常的表观遗传修饰在SSc发生、发展中的作用及其机制。以上研究,将为揭示表观遗传修饰在SSc发病中的作用及机制提供重要的理论依据,并为SSc的诊断、治疗及预后判断提供新的线索。第一部分DNA去甲基化酶在SSc患者CD4+T细胞病理性低甲基化及发病中的作用第一节SSc患者CD4+T细胞中Tets的表达目的SSc患者CD4+T细胞DNA低甲基化在SSc的发病中起重要作用,然而其低甲基化的分子机制尚未阐明,Tets蛋白(Ten-eleven translocation)能够去除甲基化标记,发挥去甲基化的功能,从而减少表观遗传基因的沉默。因此,我们检测SSc患者CD4+T细胞中Tets的表达水平,整体基因组DNA羟甲基化状态及其与疾病表型的关系。方法密度梯度离心法分离18例系统性硬皮病患者和20例正常对照者PBMCs,免疫磁珠法分选CD4+T细胞。实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)和免疫印迹法(Western blot)检测Tets的RNA和蛋白水平表达水平；应用整体羟甲基化定量试剂盒检测整体基因组DNA羟甲基化水平；并分析Tets和与整体基因组DNA羟甲基化水平及疾病活动性评分(SDAI)和皮肤硬度评分(MRTSS)的相关性。结果与正常对照组相比,SSc患者CD4+T细胞中Tetl mRNA和蛋白表达水平明显上调(P=01.021,P=0.035)；Tet2,Tet3mRNA表达无统计学差异(P>0.05):SSc患者CD4+T细胞中基因组DNA整体羟甲基化水平增高(P=0.026)；且SSc患者CD4+T细胞中Tet1mRNA转录水平与整体基因组DNA羟甲基化及疾病活动评分(SDAI)呈正相关(R=0.594,P=0.009:R=0.479,P=0.042).结论SSc患者CD4+T细胞中Tetl表达显著升高及整体基因组DNA羟甲基化显著增高,且与疾病的活动度相关联,可能在SSc的发病中起重要作用。第二节下调Tet1表达抑制SSe患者CD4+T细胞自身免疫反应目的抑制Tetl表达对SSc患者CD4+T细胞甲基化敏感基因CD40L、CD70调控序列甲基化状态、基因表达、以及自身免疫反应的影响。方法密度梯度离心法分离5例系统性硬皮病患者PBMCs,免疫磁珠法分选CD4+T、B细胞。设计针对Tetl的小干扰RNA,电穿孔法瞬时转染siRNA-Tet1或阴性对照siRNA进入SSc患者CD4+T细胞；转染后48小时利用real-time PCR和Western blot检测Tetl的mRNA及蛋白水平变化；利用real-time PCR和流式细胞仪检测转染后CD4+T细胞中CD40L、CD70基因和蛋白表达水平；ELISA法检测细胞增殖活性和IgG抗体产量；通过epigentek公司生产的整体基因组DNA羟甲基化定量检测试剂盒检测整体基因组DNA的羟甲基化水平；同时利用亚硫酸氢钠盐基因组测序检测CD40L、CD70基因启动子区的甲基化水平。结果与转染阴性对照siRNA组相比,转染siRNA-Tet1的SSc患者CD4+T中Tet1、CD40L、CD70的mRNA及蛋白水平明显降低(P<0.05)；细胞增殖活性及自身B细胞的IgG抗体产量下降(p=0.008,P=0.019)；整体基因组DNA的羟甲基化水平明显降低(P=0.024)。CD40L、CD70基因启动子区域平均甲基化水平均显著升高(P<0.05)。结论抑制SSc患者CD4+T细胞中Tetl的表达,可引起整体基因组DNA羟甲基化水平降低,自身免疫密切相关的甲基化敏感基因CD40L、CD70启动子甲基化水平升高,下调这两个基因的表达、抑制自身免疫反应。第二部分SSc患者CD4+T细胞CD70(TNFSF7)基因启动子区域组蛋白H3乙酰化修饰的研究目的哺乳动物细胞中组蛋白乙酰化常常与DNA甲基化状态一起调节基因表达,SSc患者CD4+T细胞CD70基因调控序列存在低甲基化,但其调控区域的组蛋白乙酰化修饰的情况未见报道。本研究主要探讨SSc患者CD4+T细胞TNFSF7核心启动子区域H3ac水平与疾病的关系。方法密度梯度离心法分离10例SSc患者和10例正常对照者PMBC,免疫磁珠法分选CD4+T细胞,real-time PCR法检测CD70的mRNA转录水平,染色质免疫沉淀(ChIP)方法结合real-time PCR法检测NFSF7启动子区域H3乙酰化水平。结果SSc患者CD4+T细胞TNFSF7启动子H3ac水平较正常对照升高(P=0.008)；且SSc患者CD4+T细胞TNFSF7启动子H3乙酰化与CD70mRNA及疾病活动度评分SDAI呈正相关(R=0.691,P=0.027；R=0.719,P=0.019).结论SSc患者CD4+T细胞CD70过度表达及疾病活动情况可能与TNFSF7启动子特定区域组蛋白H3乙酰化程度增加有关。第三部分SSc患者CD4+T细胞中microRNAs表达谱研究目的研究系统性硬皮病CD4+T细胞中microRNA表达谱变化。方法密度梯度离心法分离5例SSc患者和5例正常对照者PBMCs,免疫磁珠法分离CD4+T细胞,用TRIzol试剂提取总RNA及microRNA,应用美国联川生物公司的microRNA基因芯片技术检测CD4+T细胞中异常表达的microRNA,并应用Real-time PCR法对18例SSc患者和20例健康对照中进行芯片结果验证,并对验证后的microRNA进行靶基因预测。结果microRNA基因芯片结果显示：和正常对照组相比,在SSc患者外周血CD4+T细胞中表达增高的microRNA有miR-451a, miR-126, miR-21, miR-223等16个,表达下降的microRNA有miR-5100,miR-146a, miR-150, miR-142-5p等8个(p<0.01)。Real-timePCR法验证的结果与芯片的结果一致。靶基因预测结果发现这些差异表达的microRNAs与DNA甲基化,组蛋白修饰及免疫炎症信号通路相关。结论SSc患者组CD4+T细胞中microRNA表达异常可能参与SSc的发病。