牙鲆(Paralichthys olivaceus,P.olivaceus)隶属鲽形目(Pleuronectiforms)、牙鲆属(Paralichthys),是我国重要的一类海水经济鱼类。在牙鲆生长发育过程中,雌雄个体间存在明显差异,雌性个体大而且生长迅速。因此,研究牙鲆鱼类的性腺分化与发育机制有利于在生产上偏向单性养殖,具有重要的经济应用前景。近年来,较多的研究集中在牙鲆性腺发育相关基因的克隆与表达分析,但在蛋白水平关于牙鲆雌雄性腺差异蛋白质的表达研究较少,因此,研究牙鲆雌雄性腺差异蛋白质组学对于揭示其性腺发育的分子机制具有重要的理论意义。相对和绝对定量同位素标记技术(isobarictags for relativeand absolute quantitation,i TRAQ)是在蛋白组学上发展起来的一项新兴的生物技术,它可以同时标记8种不同样品,进行相对和绝对定量分析,此项技术可用于定性与定量同步进行,具有灵敏性高、高通量、分离能力强、结果可靠等特点,近年来,被应用在多种学科和领域。本研究运用i TRAQ技术,对一龄性腺发育II期牙鲆雌雄性腺中蛋白质组进行定量和定性分析,通过Triple TOF 5600质谱仪系统进行质谱分析,产生二级谱图数、解析的二级谱数分别为361050,51910;实验鉴定到至少包含2个unique肽段的蛋白数为1444,占总蛋白数的51.36%;鉴定到最多的肽段长度为11,其平均长度为13.28,符合肽段长度合理范围;以差异倍数≥1.5或者≤0.67倍,P-value≤0.05的条件下,蛋白显著差异数量总共为191,其中上调蛋白118个,下调蛋白73个。对差异蛋白进行GO富集分析,在生物进程中富集到了与性腺相关的功能条目:雌性性别分化(Female sex differentiation)、胚胎发生(Embryonic morphogenesis)、分化过程中细胞形态发生的正向调节(Positive regulation of cell morphogenesis involved in differentiation)、ERK1和ERK2级联的调节(Regulation of ERK1 and ERK2 cascade)、类固醇激素受体信号通路的调节(Regulation of steroid hormone receptor signaling pathway)、精子发生(Spermatogenesis)、雄性配子世代(Male gamete generation)、生殖细胞发育(Germ cell development)等。其差异蛋白主要存在于细胞质膜、性染色质和细胞骨架中;对差异蛋白Pathway富集分析,发现在类固醇生物合成(Steroid biosynthesis)、MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)、Wnt信号通路(Wnt signaling pathway)、孕酮介导的卵母细胞成熟(Progesterone-mediated oocyte maturation)中都发现了一些可能与性腺发育相关的蛋白,初步筛选出heat shock protein family A member 8(HSPA8)、β-catenin、cytochrome P450 11beta(CYP11B)、17-beta hydroxysteroid dehydrogenase type 1(17β-HSD1)、calretinin(CALB2)、fragile X mental retardation 1(FMR1)、WD40 repeat protein 1(WDR1)几种蛋白。CALB2蛋白在磷脂酰肌醇信号系统、促性腺激素释放激素的信号通路中表达下调;FMR1蛋白在RNA转录信号通路中表达上调;WDR1蛋白在p53信号通路、RNA降解通路中表达上调,三者在哺乳动物生殖中已有报道,但其在鱼类性腺发育与分化中的功能则少有研究,故选取CALB2、FMR1、WDR1三种蛋白进行验证和功能初步研究。按照NCBI数据库信息,设计相应引物,克隆验证三个蛋白的基因序列,再运用DNAMAN与其他物种序列进行同源比对、MEGA构建系统进化树等生物信息分析。克隆得到calb2基因全长1456 bp,其中CDS为816 bp,编码271个氨基酸,预测其蛋白分子量约为31.52 k Da,与尼罗罗非鱼同源性最高(97%),二级结构预测到有6个EFh手型结构;fmr1基因全长2826 bp,CDS为1833 bp,编码610个氨基酸,其蛋白质的分子量约为66.27 k Da,同源性与尖吻鲈最高(94%),二级结构预测到两个KH结构域,当发生KH结构域的点突变时可使FMRP失去结合RNA的能力;wdr1基因全长2988 bp,CDS为1821 bp,编码606个氨基酸,预测其分子量约为65.95 k Da,同源性与杜氏鰤最高(87%),二级结构预测到11个WD结构域。通过荧光定量PCR方法对calb2,fmr1和wdr1三个基因在牙鲆不同组织和不同发育时期的表达情况进行分析。结果表明,牙鲆三个差异性基因在成鱼各组织中都有不同水平的表达,其中calb2基因在牙鲆脑中表达量最高,在性腺中也有较高的表达量,而且在精巢和卵巢两个组织中表达量上有极显著差异(P<0.01),在精巢的表达量大约是卵巢中的3倍左右;fmr1基因在卵巢中相比于其他组织有极高的表达,与精巢相比表达量大约高出9倍左右;wdr1基因在牙鲆卵巢中的表达量丰富,精巢中次之。通过western blot对其在卵巢和精巢中的表达量进行分析,发现与荧光定量PCR的结果一致,CALB2在精巢中有较高表达,而FMR1和WDR1则在卵巢中的表达量较高。这个结果也与i TRAQ定量的结果一致,说明使用蛋白表达谱i TRAQ技术筛选牙鲆性腺相关差异蛋白的结果可靠。进一步通过免疫组化的方法对CALB2蛋白在牙鲆精巢和卵巢中的表达进行定位,发现在卵巢中,主要在卵巢生殖上皮检测到CALB2阳性信号;在精巢中,则主要在精小叶外部间质细胞中检测到阳性信号。温度和激素是影响鱼类性腺分化的重要环境因子,为探讨calb2,fmr1和wdr1在牙鲆早期性腺分化中的作用,研究了高温和激素处理对三者在牙鲆早期性腺分化过程中的影响,设置高温(28℃)、雌激素(17β-E2,10μg/L)、雄激素(17α-MT,10μg/L)处理组和常温(20℃)对照组培育性腺分化早期的牙鲆幼鱼(30~105 days post hatching(dph))。结果发现高温会抑制calb2基因在牙鲆性腺中的表达,而雄激素又会诱导calb2基因表达提前,但是同时会降低calb2基因的表达量;高温会抑制fmr1在性腺中的表达,同时在雌、雄激素条件下,fmr1表达也出现均降低的情况;然而雌激素和雄激素对wdr1基因表达影响显著,对其在性腺分化时期表达有促进作用。