论文部分内容阅读
人参是我国非常名贵的中药材之一,其有效成分人参皂苷的含量随栽培地域环境的变化差异较大。研究人参皂苷合成关键酶基因表达与皂苷含量和主要生态因子的关系,可为阐明人参皂苷合成的的生理生态机制提供理论依据。本文对人参HMGR、SS和SE基因进行了克隆及表达分析,测定了人参总皂苷含量,并分析了关键酶基因表达量与总皂苷和生态因子的关系。主要研究结果如下:1.以五年生人参根组织为试验材料,采用RT-PCR方法对人参HMGR、SS及SE基因进行克隆;利用生物信息学技术对各基因核苷酸序列及氨基酸序列进行分析。结果表明,HMGR基因全长片段大小为1750 bp,开放阅读框长1722 bp,编码573个氨基酸;HMGR编码的蛋白包含2个跨膜区域及5个保守结构位点。SS基因全长片段大小为1256 bp,开放阅读框长1248 bp,编码415个氨基酸;SS编码的蛋白包含2个跨膜区域和2个保守结构位点。SE基因全长片段大小为1636 bp,开放阅读框长1611 bp,编码536个氨基酸;SE编码的蛋白含有4个跨膜区域及5个保守结构位点。2.以五年生人参根组织为试验材料,建立人参GAPDH基因实时荧光定量RT-PCR方法。将PCR扩增获得的人参GAPDH基因片段连接到p MD20-T载体上构建重组质粒,经1/10梯度稀释后,以SYBR GreenⅠ为荧光染料制作标准曲线,同时进行熔解曲线分析,并对反应的特异性、灵敏性和重复性进行检测。结果表明,该方法检测GAPDH基因的最低拷贝数为36拷贝/μL,在较广的范围内(36~3.6×107拷贝/μL)有良好的线性关系(R2=0.9964);熔解曲线结果表明扩增产物为特异性单峰,其Tm值为(84.57±0.01)℃;5个不同浓度对照品组内试验变异系数为0.54%~2.77%,组间试验变异系数为2.60%~4.39%。该方法具有灵敏、特异、快速及重复性强等优点,为进行人参功能基因表达的定量分析奠定了方法学基础。3.以五年生人参根组织为试验材料,对人参HMGR、SS及SE基因表达量与总皂苷含量进行测定,并对各基因表达量与生态因子和总皂苷的关系进行分析。结果表明,HMGR、SS和SE基因表达量从盛花期至红果期逐渐升高,在果熟期表达量有所下降,但仍具有较高的表达量;总皂苷含量从盛花期至果熟期逐渐升高,说明人参生长后期是其质量形成的关键期。在海拔300 m~800 m的集安、敦化和抚松地区,HMGR、SS和SE基因表达量和总皂苷含量随海拔升高而增加,在海拔900 m~1200 m的长白地区,各基因表达量和总皂苷含量随海拔升高而下降;适合于关键酶基因表达和人参皂苷积累的最佳海拔高度可能在700 m~900 m范围内。平均温度、日照时数及月降水量对基因表达和人参皂苷的合成有重要作用,以平均温度影响作用最大,而相对湿度和月蒸发量对基因表达和人参皂苷的合成影响较小。不同生长时期人参HMGR、SS和SE基因表达量与总皂苷含量之间存在明显的正相关关系,不同海拔高度人参各基因表达量与总皂苷含量之间也呈现明显的正相关关系,说明关键酶基因表达对人参皂苷合成具有重要影响。