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目的高脂饮食与炎症性肠病的发生发展密切相关。已有研究表明高脂饮食导致的肠道高脱氧胆酸(DCA)可引起结肠炎症性损伤,但其机制尚未完全阐明。越来越多的研究显示NLRP3炎性小体在肠道炎症的发生发展中发挥重要作用。我们的研究主要探讨脱氧胆酸通过激活NLRP3炎性小体引起炎症性肠病的作用及机制。方法第一部分我们以不同浓度DCA刺激LPS预致敏的小鼠巨噬细胞(细胞系及骨髓来源巨噬细胞),未经DCA处理组做对照,利用western blot,ELISA技术检测NLRP3炎性小体活化相关的关键分子caspase-1以及成熟IL-1β的表达与分泌。进而以si RNA技术下调巨噬细胞NLRP3的表达水平或以caspase-1抑制剂阻断NLRP3炎性小体活化,ELISA法观察对DCA诱导成熟IL-1β分泌的影响,明确DCA对巨噬细胞NLRP3炎性小体的激活作用。第二部分由于NLRP3炎性小体的激活机制主要包括三种模式:细胞内活性氧(ROS)产生、溶酶体内组织蛋白酶B(cathepsin B)释放、细胞内K~+外流。因此,我们利用DCA刺激LPS预致敏的小鼠巨噬细胞,应用荧光染色检测胞内ROS产生、溶酶体完整性以及cathpsin B释放情况,电感耦合等离子体发射光谱(ICP-OES)检测细胞内K~+含量变化;预先分别抑制ROS产生、cathepsin B释放、细胞内K~+外流后,ELISA检测DCA刺激巨噬细胞产生成熟IL-1?的水平变化。为进一步弄清DCA活化NLRP3炎性小体的相关分子机制,以抑制剂或si RNA技术分别阻断小鼠巨噬细胞不同的胆汁酸受体,再以DCA进行刺激,观察对IL-1β分泌、胞内ROS产生、cathpsin B释放等情况的影响,明确DCA激活巨噬细胞炎性小体的模式及分子机制。第三部分以葡聚糖硫酸钠盐(DSS)诱导小鼠急性肠炎为模型,设立饮水对照组、DSS组、DSS联合肠道内给予DCA组、DSS联合肠道内给予DCA+caspase-1抑制剂组,动态记录小鼠精神状态、体重变化、粪便性状等,评价疾病活动指数;造模结束后,结肠组织切片进行HE染色及免疫组化染色检测炎性细胞浸润、肠粘膜病理学损伤情况;肠组织匀浆,检测成熟IL-1β水平以及髓过氧化物酶(MPO)活力,探讨NLRP3炎性小体活化在DCA加重DSS诱导小鼠肠炎中的作用。进而同样以DSS诱导小鼠急性肠炎为模型,利用脂质体注射去除小鼠体内巨噬细胞,观察巨噬细胞在DCA加重DSS诱导肠道炎症中的作用。第四部分给予野生型C57BL/6小鼠含0.2%DCA的膳食,模拟肠道长期高DCA状态,以正常饮食小鼠为对照,观察肠道炎症发生情况。结肠组织切片进行HE染色观察肠粘膜病理学损伤情况,western blot检测成熟IL-1β水平,荧光定量PCR检测IL-6,MCP-1等炎性因子的表达,肠组织匀浆检测MPO活力,从而研究肠道长期高DCA对肠炎的诱导作用。结果第一部分DCA可明显诱导巨噬细胞NLRP3炎性小体活化和促炎性细胞因子IL-1β产生,并且该作用呈时间和剂量依赖性。第二部分DCA通过引起溶酶体内cathepsin B的释放从而导致NLRP3炎性小体活化和IL-1β的成熟分泌,该作用主要由巨噬细胞膜上的胆汁酸受体1-磷酸鞘氨醇受体2型(S1PR2)所介导,阻断S1PR2或cathepsin B释放后,可显著抑制DCA诱导的IL-1β成熟分泌。第三部分肠内给予DCA可明显加重2.5%DSS诱导的小鼠肠道炎症及损伤。与单纯DSS组相比,表现为小鼠体重显著下降、血便、稀便,并且结肠组织产生高水平成熟IL-1β以及更为严重的肠粘膜病理损伤。以caspase-1抑制剂阻断NLRP3炎性小体活化或者清除小鼠体内巨噬细胞均可明显减轻DCA导致的小鼠肠道炎症性损伤。第四部分给予野生型C57BL/6小鼠含0.2%DCA的膳食3个月后,HE染色可观察到小鼠结肠炎症性改变,IL-6,MCP-1 m RNA水平表达明显增高,同时结肠组织成熟IL-1β产生显著增加。结论本研究结果表明肠道高DCA可能作为一种内源性危险信号活化NLRP3炎性小体,引起促炎性细胞因子释放,这可能是高脂饮食诱导肠道炎症的重要因素之一。NLRP3炎性小体可能成为治疗IBD的靶点。