研究背景衬覆于血管内膜表面的肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs)是血液运输屏障的重要组成部分,具有物质交换炎性介质等选择性调节功能;PMVECs在维持内环境动态平衡中也发挥着关键性作用;此外,细胞内、外的信号刺激引起PMVECs功能的变化是影响微血管通透性改变的关键因素。由于微血管内皮细胞结构破坏,通透性增加引起的血管渗漏仍然是导致许多炎症性疾病发病的主要机制之一。急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)的重症患者死亡率接近45%,炎症的过度激活所致PMVECs通透性增加是其主要的病理特征。粘附连接是血管内皮连接的主要方式,可直接调节细胞骨架,与血管内皮通透性密切相关;粘附连接也参与建立和维持细胞间粘附、骨架重塑、信号传导及转录后调控等多种细胞功能。IQGAPs(IQ-domain GTPase-activating proteins,IQGAPs)是一类含有多域结构的真核细胞蛋白家族。作为细胞骨架结合蛋白的IQGAPs在调控胞质分裂、细胞迁移、组织重塑、细胞黏附和细胞信号转导等生物学进程中占有重要地位。IQGAPs蛋白家族包括IQGAP1,IQGAP2和IQGAP3三个成员。IQGAP1分布广泛,除了脑组织外,各组织和器官均有分布,在肺脏表达水平较高。IQGAP1是由1657个氨基酸组成的肌动蛋白调节蛋白,在维持细胞骨架正常粘附功能和细胞间连接中发挥着主要的作用。因此IQGAP1被认为是维护微血管内皮细胞单层通透性和完整性的关键因素之一。近年来,已有研究证实IQGAP1的缺失会影响血管内皮细胞的通透并导致血管渗漏,但是其具体机制以及是否也存在于炎症诱导下肺微血管内皮细胞单层通透性的改变,尚不明确。核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)是Rel/NF-κB家族多肽成员组成的一组诱导型转录因子。在微生物感染、应激、创伤等外界物质刺激下,其活性可以异常升高,导致大量促炎因子的过度释放。目前已有文献报道,在ARDS中NF-κB信号传导通路被激活,参与多种炎症因子的表达,调控ARDS的发生、发展并影响其预后。作为革兰阴性菌细胞壁主要成分的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)不仅可以诱导血管内皮细胞通透性的增加;而且,从目前已知的机制中可以证实,LPS存在激活部分细胞内信号转导通路,损伤内皮细胞间连接,破坏细胞骨架,导致细胞通透性增高。大量临床资料也证实LPS参与ARDS的发生发展,然而NF-κB作为炎症反应基因大量表达的控制点,在LPS诱导PMVECs通透性的改变中被激活,是否能影响IQGAP1的表达变化及其作用机制,目前尚未见相关报道。研究目的本研究以大鼠PMVECs(rat pulmonary microvascular endothelial cells,RPMVECs)表达的IQGAP1为研究对象,在不同干扰因素的影响下,分析IQGAP1的表达以及对PMVECs通透性调控的信号途径和分子机制的影响。在LPS诱导PMVECs单层通透性增加的过程中,初步探讨NF-κB信号通路参与LPS对IQGAP1的调控及机制研究。旨在为诸如ARDS等PMVECs单层通透性改变疾病的机制研究,提供分子生物学实验证据。研究方法1、原代RPMVECs体外分离、培养和鉴定;2、鉴定RPMVECs上IQGAPs的存在及亚型的表达。3、检测LPS诱导RPMVECs中IQGAP1的表达变化。4、体外构建慢病毒感染IQGAP1低表达和过表达的RPMVECs稳定感染细胞并鉴定。5、利用transwell chamber,在体外构建RPMVECs单层细胞模型。用不同浓度和时间的LPS诱导干预RPMVECs单层融合细胞,监测跨内皮细胞电阻(TER)的变化,分析LPS对RPMVECs单层通透性的作用。6、在LPS干预条件下,观察并分析IQGAP1正常表达、低表达和过表达的RPMVECs上骨架蛋白F-actin的变化。7、利用RNA-Sequencing,分析IQGAP1的低表达对RPMVECs中mRNA表达变化的影响,并筛选出有意义的DEGs;通过GO、KEGG等mRNA功能富集分析,探讨与IQGAP1表达相关的关键基因和参与RPMVECs生物学过程的信号通路。8、通过Western blot观察:经si RNA介导NF-κB干扰抑制后,IQGAP1和NF-κB P65的表达情况;经LPS和NF-κB抑制剂CAPE诱导作用下,在IQGAP1低表达、正常表达和过表达情况下,NF-κB P65的表达变化及二者是否具有相关性。9、利用transwell chamber,在体外分别构建IQGAP1正常表达、低表达和过表达的RPMVECs单层细胞模型。按实验设计,部分实验组先给予NF-κB抑制剂CPAE预处理,再给予LPS诱导干预,监测不同TER变化,并分析对RPMVECs单层通透性的影响。研究结果1、体外成功分离、培养原代RPMVECs,经形态学,VIII和CD34免疫染色鉴定证实。2、PMVECs上存在IQGAPs三种亚型,经免疫荧光、Western blot、q RT-PCR已证实;IQGAP1的表达含量最高,主要位于质膜和细胞连接处。3、10μg/ml LPS诱导作用PMVECs 12个小时,经证实IQGAP1表达量最高。4、利用慢病毒感染,构建IQGAP1低表达和过表达的PMVECs稳转株,通过观察GFP,且经Western blot、q RT-PCR检测证实构建成功;依据上述结果及感染效率分析,选择合适稳转株进行后续实验。5、10μg/ml LPS作用浓度诱导PMVECs的TER值最小,PMVECs单层通透性最大;用10μg/ml LPS的9个不同时间点作用PMVECs,发现第12小时的TER值最小,PMVECs单层通透性最大;综上所述,10μg/ml LPS作用PMVECs第12小时,TER值最小,PMVECs单层通透性最大。6、在正常对照组的PMVECs中,F-actin主要分布在细胞周边,靠近细胞连接处,有序排列于细胞膜内侧,呈细丝状;在细胞核的周围可有少量分布,以形成核骨架;当10μg/ml LPS诱导第12个小时,可观察到PMVECs中Factin聚集和重构,形成了部分F-actin粗应力纤维;慢病毒感染对照组和下调IQGAP1表达组中PMVECs的F-actin表达水平和形态变化,与正常对照组相比均无明显变化;但给予LPS诱导刺激低表达IQGAP1组,可以发现F-actin形成显著减少,未见明显应力纤维形成。7、运用RNA-Sequencing,分析与PMVECs上与IQGAP1低表达有关的mRNA,结果如下:(1)共鉴定出1,216个DEGs(p值≤0.05,倍数变化(29)1.5且组内FPKM均值≥0.5),包含665个上调mRNA,551个下调mRNA,并通过q RT-PCR验证,结果一致;同时鉴定出与上调DEGs相关的33条信号通路;与下调DEGs相关的73条信号通路。(2)GO功能富集分析:上调关键DEGs多与DNA复制、细胞周期等相关,如:Mcm3,Cdc7;而下调关键DEGs多与细胞骨架、细胞连接和细胞外基质等有关,如ICAM-1、IL-6。IQGAP1的低表达引起了细胞的增殖、血管发育的下调,抑制IQGAP1的表达影响了PMVECs的完整性,表明IQGAP1可能在PMVECs屏障修复和损伤中起着重要的作用。(3)KEGG富集分析:上调的途径主要与细胞凋亡、蛋白质合成和内皮的某些修复过程有关,如p53、AMPK信号通路等。然而由IQGAP1敲低引起的最显著差异信号下调途径,多与炎症有关:如NF-κB、TNF和IL-17信号通路等。8、经si NF-κB干扰抑制,慢病毒感染诱导IQGAP1低表达和过表达,且在LPS和CAPE诱导作用下,通过Western blot证实,LPS通过NF-κB信号途径,促进了IQGAP1的表达;IQGAP1也可以反馈调节NF-κB,减少刺激对PMVECs的损伤。9、给予10μg/ml LPS刺激IQGAP1不同表达的PMVECs各组,显示TER均于30 min开始显著下降,12小时降低至最大值;抑制IQGAP1表达可减少LPS诱导的TER降低,IQGAP 1过表达组在LPS诱导下TER下降更明显;但预先给予NF-κB抑制剂CAPE处理后,再予以LPS刺激的实验组与未予以CAPE处理的LPS组对比电阻值下降显著降低。综上所述,CAPE可减轻LPS导致的跨细胞单层电阻降低,抑制IQGAP1表达后可在此基础上进一步减轻但仍然低于正常组。研究结论1、PMVECs上存在IQGAPs家族三种亚型IQGAP1、IQGAP2和IQGAP3,其中IQGAP1表达含量最高,主要分布在细胞质膜和细胞连接处。2、10μg/ml LPS作用PMVECs 12个小时,IQGAP1表达量上调最明显,TER值最小,PMVECs单层通透性最大,且呈浓度和时间依赖的方式。3、LPS诱导PMVECs骨架重组增加,部分依赖于IQGAP1的存在。4、RNA-Sequencing分析显示抑制IQGAP1的表达会影响微血管内皮细胞屏障的完整性,IQGAP1可能在内皮细胞屏障修复和损伤中起着关键性作用。5、LPS激活NF-κB信号途径上调IQGAP1的表达;IQGAP1可以反馈调节NF-κB,减少刺激对PMVECs的损伤。6、抑制IQGAP1表达,下调NF-κB信号通路,可减轻LPS致PMVECs单层通透性的增高。