论文部分内容阅读
水稻是保障世界粮食安全最重要的作物之一。近年来,随着种植面积的不断下降和粮食需求的日益增长,着力提高水稻单产已成为解决粮食安全问题的重要方向。水稻90%以上的干物质来源于光合作用,提升叶片光合速率、促进其生物量的积累,是水稻单产提高的关键。当前,关于叶片结构、气体交换、Rubisco酶活性、营养元素、波动光以及各种环境因子等对光合作用的影响,前人已开展了大量研究,而作为光合作用的主要色素,水稻叶绿素含量及其荧光特性在不同水稻品种的基因型差异及调控机理却少见报道。为此,本研究从3K水稻基因组计划（3K Rice Genome Project,3K RGP）、华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室迷你核心品种库、作物生理与栽培研究中心历史栽培品种中挑选了173个生育期接近的水稻品种作为供试材料,于2018、2019年在大田条件下测定了各品种齐穗期剑叶的相对叶绿素含量（RC）和叶绿素荧光参数（NPQt、Phi2、Phi NO、Phi NPQ、LEF、Fv P/Fm P、G、q L和q P）,分析了各指标的基因型差异、相关性及其聚类和差异特征。在大田表型测定的基础上,利用NGS高通量测序和全基因组关联（GWAS）分析方法筛选和鉴定调控水稻相对叶绿素含量（RC）和非光化学淬灭（NPQt）等性状的候选基因;挑选不同遗传背景,RC和NPQt性状特异的2个代表性品种,利用转录组学（RNAseq）分析,筛选差异表达基因（DEG）,通过GO功能注释和KEGG代谢通路的富集分析,从基因表达层面进一步鉴定候选基因和转录因子;对筛选到的重点转录因子基因家族进行鉴定分析。主要研究结果如下:（1）水稻相对叶绿素含量RC及荧光参数NPQt、Phi2、Phi NO和Phi NPQ存在显著的基因型差异。水稻RC的变化范围为33.3～68.4,NPQt的变化范围为0.26～4.41,Phi2的变化范围为0.01～0.44,Phi NO的变化范围为0.20～0.63,Phi NPQ的变化范围为0.14～0.87。相关性分析结果表明,NPQt与Phi NPQ显著正相关、与Phi2显著负相关,Phi NO与Phi NPQ显著负相关,RC与Phi2显著负相关。（2）水稻叶绿素荧光参数NPQt、Phi2、Phi NO和Phi NPQ聚类分析结果表明173个水稻品种可以分成3组,不同组别水稻品种的荧光参数具有广泛和显著的差异,且分布趋势和前文相关性分析的结果基本一致。第1组具有低NPQt、Phi NPQ和高Phi2、Phi NO;第2组具有中等的NPQt、Phi2、Phi NO和Phi NPQ;第3组具有高NPQt、Phi NPQ和低Phi2、Phi NO。结果可见,NPQt与Phi NPQ呈现趋势一致性,都可以反映水稻非光化学淬灭能力;NPQt/Phi NPO与Phi2、Phi NO趋势相反,可以反映水稻光合作用中非光化学淬灭与光系统Ⅱ光化学效率、调制性能量耗散量子产量与非调制性能量耗散量子产量,在水稻光合作用能量分配过程中的相互影响和关系。（3）筛选到调控RC性状的候选基因8个、调控NPQt性状的候选基因4个。在水稻4号染色体上定位到与RC性状相关的基因区域（32158 kb–32427kb）筛选到60个候选基因,通过Rice Anther Net数据库分析,进一步筛选到Os04g0634500（RLCK166）、Os04g0635900（DNA repair）、Os04g0636100（Glycosylhydrolase）、Os04g0631600（bHLH）、Os04g0637000（BZIP37）,共5个基因在水稻叶片中高表达;s04g0632100（RLCK163）、Os04g0632300（RLCK379）、Os04g0633800（RLCK165）,共3个基因在水稻叶片中低表达。在水稻2号染色体上定位到与NPQt性状相关的基因区域（4498 kb–4698kb）筛选到29个候选基因,通过Rice Anther Net数据库分析,进一步筛选到Os02g0182100（RR24）和Os02g0182800（HOS58）,共2个基因在水稻叶片中高表达,Os02g0181900（CLPB-M）和Os02g0181300（WRKY71）,共2个基因在水稻叶片中低表达。（4）筛选到不同遗传背景,RC和NPQt性状特异2个水稻品种的差异表达基因2366个,其中上调表达基因1434个;筛选到重点候选转录因子bHLH。对差异表达基因的功能注释（GO）和代谢通路（KEEG）进行富集分析显示,一共富集到263个GO条目,其中富集到生物过程的GO条目最多,达到138个（占比52.5%）,最显著的为GO:0006468蛋白质磷酸化（protein phosphorylation）;富集到分子功能的GO条目为106条（占比40.3%）,最显著的为GO:0032559腺苷酸结合（adenyl ribonucleotide binding）;富集到细胞组分的GO条目为19条（占比7.2%）,最显著的为GO:0031224膜的固有成分（intrinsic component of membrane）。KEGG富集分析到11条显著代谢通路,富集因子中最显著的是苯丙烷生物合成（Phenylpropanoid biosynthesis）途径（dosa00940）,涉及相关差异基因有25个,占通路基因数量的12.0%,其中包括上调基因18个,下调基因7个。挑选全基因组关联（GWAS）分析和转录组分析共同鉴定的4个调控RC性状的重点候选基因（Os04g0634900、Os04g0632000、Os04g0636400、Os04g0631600）采用q PCR方法检测其基因表达水平,检测结果与转录组学FPKM值具有较好的一致性,进一步验证试验结果的可信度。（5）重点候选转录因子水稻bHLH基因家族的鉴定和分析。该基因家族可细分为G-box-binding、Non-G-box、Non-E-box、Non-DNA-binders 4个亚家族,分别含有97个、17个、19个和36个基因,解析基因结构和功能,补充了水稻bHLH基因家族的成员。综上所述,水稻相对叶绿素含量RC及荧光参数NPQt、Phi2、Phi NO和Phi NPQ存在显著的基因型差异;叶绿素荧光参数间存在显著的相关性,并与聚类和差异分析呈现的趋势基本一致,这些表明水稻相对叶绿素含量和荧光参数具有丰富的遗传变异;筛选到调控RC性状、NPQt性状的候选基因及转录因子,本研究可以为后续水稻高光效品种选育与栽培管理,提供基因资源和研究指导。