附子（Fuzi）是名中药之一,主治元气大亏,阳气暴脱,脉微欲绝。中医临床应用已有几千年历史,被誉为“回阳救逆第一药”。因其功效突出,临床上多采用参附配伍（参附方,Shenfu Decoction）方式等广泛治疗心衰等疾病,临床不良反应报道呈递增趋势,因此限制了其临床应用。国内外学者对附子毒性进行广泛和深入的研究,研究显示药典规定剂量下附子水提组分能够明显增强离体心脏功能,呈现一定的“量-效”关系;大剂量下离体心脏功能随着剂量的增大表现出心肌收缩力量不足,心输出量减少的毒副作用,呈现一定的“量-毒”关系^[1]。不同煎煮时间对附子毒效组分与毒性成分有显著影响,附子煎煮的过程中,乌头类双酯型二萜类生物碱可水解成单酯型二萜类生物碱,继续水解则生成胺醇类物质几乎没有毒性。但上述工作尚没有从体内药物相互作用的角度进行整合分析和深入探寻。本课题组建立了检测药物对P450酶产生诱导或抑制的技术平台,系统研究了参附方对药物代谢酶的影响,发现方中物质成分乌头碱是CYP3A的底物,同时对CYP酶具有明显的诱导作用,但这种作用是否受PXR介导仍不十分清楚?本文将以附子为研究对象,提出“PXR-CYP3A在参附方的毒效关系转换中发挥重要作用”的科学假说,揭示PXR-CYP3A在参附方毒-效关系转换中的作用和地位,为中药“毒-效”整合分析研究提供新靶点;建立整合核受体-药物代谢酶表达复方“毒-效”整合分析研究的新模式。由核受体PXR（pregnane X receptor）,AhR（constitutive androstane receptor）,CAR（constitutive androstane receptor）介导调控的药物代谢酶（Cytochrome p450,CYP）参与70%药物的代谢,是体内最重要的药物代谢酶,主要分布于肝脏。近年来,CYP相关研究越来越受到重视。然而,作为体外CYP研究中最理想的细胞模型,人源原代肝细胞（primary human hepatocytes）,分离培养过程耗时长且成本高昂。而人源传代细胞不仅易于培养,成本低廉,同时细胞特性与原代细胞相似。但肝脏中细胞种类多样,经典的药物代谢酶检测实验中忽视了适用不同代谢酶亚型的合适细胞模型选取问题。而我们选取了代表不同肝脏状态的三种典型的人源传代肝细胞,通过三种肝细胞系的比较,确定适合后续PXR-CYP3A4研究的细胞类型。同时展示了人源传代肝纤维细胞LX-2中几种CYP亚型的基因和蛋白表达谱,为不同的CYP亚型研究选取合适的细胞类型提供依据。附子及其主要成分在临床上主要表现为心脏毒性,但是成分和相关作用机制缺乏深入研究。离子通道（ion channels）是各种无机离子跨膜被动运输的通路,和心脏毒性关系密切。hERG（the human Ether-à-go-go-Related Gene）通道检测被认为是药物心脏毒性评价的金标准。我们通过分子生物学结合膜片钳相关技术,检测附子水提物主要毒效单体乌头类生物碱对hERG通道作用。同时,探究其调控hERG通道途径,初步确定乌头碱可影响相关miRNA调控hERG通道,为进一步的机制研究打下坚实基础。主要研究内容概括如下:1.三种不同来源肝脏细胞CYP酶表达差异比较研究首先我们选取三种不同来源的人源传代肝细胞,细胞形态的差异提示其细胞代谢酶表达可能存在差异。选取5种CYP酶诱导剂分别处理细胞,首先检测给药后三种细胞活性变化情况,确定细胞给药浓度范围。随后以人源肝星状细胞LX-2为研究对象,采用RT-qPCR技术检测给药后CYP亚型基因表达变化。采用Western blot技术检测给药前后三种肝细胞CYP亚型蛋白表达变化并比较。最后使用荧光染色法检测给药后三种细胞中CYP3A4酶活性变化。结果发现:三种传代肝细胞在不同CYP酶亚型蛋白表达丰度上存在明显差异。提示在进行CYP酶相关体外实验时,需根据所要研究的CYP亚型选择相关细胞系。同时,本研究首次对LX-2细胞中主要CYP酶亚型表达进行检测。酶活性检测实验则提示传代细胞由于酶活性丧失可能不是酶活性实验的理想细胞模型。2.附子水提物经L02细胞代谢前后心肌细胞毒性差异比较研究制备不同浓度的附子水提物后,选取前面检测的CYP3A4蛋白表达丰度最高的人源正常肝细胞L02以附子水提物处理24小时。与对照组相比,附子水提物处理后,细胞活性未发生明显改变,但PXR和CYP3A4蛋白表达均出现明显下降。当PXR被敲低后,L02存活率在最高剂量下出现明显降低。同时收集经L02细胞代谢后的附子水提液,离心去除沉淀。另准备附子水提物一组,置于37℃,5%CO₂的环境中放置24小时后收集。选取人源传代心肌细胞AC16以此2组水提物处理24小时后比较2组细胞存活率差异。结果表明,未经L02细胞代谢的附子水提物对AC16细胞毒性更大。而AC16细胞毒性指标hERG表达也下降,提示PXR-CYP3A4在附子减毒过程中起到重要作用。3.附子主要毒效成分乌头类生物碱对心肌细胞hERG通道影响进一步探究附子水提物对心肌细胞毒性机制可能是由于水提物中主要毒效单体双酯型乌头类生物碱对hERG通道抑制作用造成的。我们选取附子水提物中三种主要双酯型乌头类生物碱:乌头碱（Aconitine）、次乌头碱（Hypaconitine）以及新乌头碱（Mesaconitine）处理AC16细胞24小时后,Western blot,RT-qPCR以及共聚焦实验检测hERG通道蛋白基因表达情况。结果显示,三种乌头类生物碱均可抑制AC16细胞中hERG蛋白和基因表达,其中以次乌头碱抑制作用最强。同时,以膜片钳实验检测给予三种生物碱前后hERG通道开闭变化。结果显示,与蛋白基因实验结果相对应,三种生物碱均可抑制hERG通道开放,其中以次乌头碱抑制作用最强。而激光共聚焦实验结果也证实了三种生物碱对hERG的抑制作用。随后我们检测不同浓度次乌头碱对hERG通道影响。蛋白基因及膜片钳实验均显示次乌头碱对hERG通道抑制作用随浓度上升而加强,IC₅₀为43.07μM。次乌头碱对hERG通道的强抑制作用提示作为附子水提物中含量最高的双酯型生物碱,在药物制备和临床使用中需密切关注其含量。4.次乌头碱通过调控相关miRNA表达从而抑制hERG通道次乌头碱对hERG通道的抑制作用机制可能和miRNA相关。首先我们总结所有涉及到调控hERG通道的miRNA,8种相关miRNA在文献中均对hERG通道有抑制作用。我们在AC16细胞中检测经次乌头碱处理前后8种miRNA的表达情况。结果发现:8种miRNA均有不同程度的表达变化,其中miR-134表达量上升最明显。进一步实验中,我们使用miRNA inhibitor抑制miR-134表达后,继续给予次乌头碱处理细胞。Western blot、RT-qPCR和共聚焦实验检测均发现次乌头碱抑制hERG蛋白基因作用减弱,提示次乌头碱可通过调控相关miRNA的表达从而抑制hERG通道开放及蛋白基因表达。