薰衣草芳樟醇合成酶的基因克隆、功能鉴定及转基因技术的研究

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通过RT-PCR方法用兼并引物从薰衣草中克隆了一个600bp的序列。在Genebank里进行序列比对后与芳樟醇合成酶具有最大的相似性,为76%。通过3’RACE和5’RACE技术克隆到了基因的全长cDNA序列,为1809bp,其蛋白序列为603个氨基酸。蛋白序列与单萜类合酶基因的蛋白序列进行比对,此序列具有单萜类合酶的所有保守氨基酸功能序列DDXXD以及5端的RR功能基团。核酸及蛋白序列功能分析表明所克隆的基因属于芳樟醇合酶基因家族,命名为Llis。设计全长引物,得到了Llis的全长cDNA。用全长引物从薰衣草中克隆到了基因组全长序列,为2320bp。对其进行分析表明,基因组序列含有6个内含子,7个外显子。Southern Blotting结果表明在薰衣草中Llis可能存在2个拷贝数。构建了Llis的原核表达载体、植物转基因表达正义及反义载体。原核表达结果表明表达出来的蛋白与所预期的蛋白大小是一致的,约为60KD。用植物表达载体经烟草叶盘转化法侵染了野生型烟草。通过ppt的筛选以及提取烟草基因组,用PCR的方法得到了转基因烟草的阳性植株。Northern Blotting结果分析表明转基因烟草的正义和反义植株都有了表达,有些没有表达可能是发生了基因沉默。以百合为材料,摸索了百合的生长愈伤以及分化的条件,为下一步的百合转基因做好了基础。
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