海马齿GRAS蛋白SpSCL1的基因克隆与功能鉴定

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GRAS蛋白是植物特有的一类蛋白家族,在植物的生长发育包括赤霉素信号转导、根的发育、分生组织的形成、光信号转导等方面发挥着重要的作用。为解析盐生植物海马齿耐盐碱的分子机制,我们实验室成功构建了海水胁迫下海马齿差异表达的cDNA消减文库,并从中筛选到一个与GRAS基因同源性较高的一个EST片段。在此基础上,本研究利用RACE技术成功获得了相应基因的全长cDNA序列,根据同源比对信息将其命名为SpSCL1。该基因cDNA序列全长2170bp,含有一个编码545个氨基酸大小为1638bp的完整开放阅读框;推导的氨基酸序列比对结果表明,该基因属于GRAS家族中的AtPATl亚家族。成功克隆了SpSCL1基因5、端上游1254bp的DNA序列,分析结果显示该片段除含有典型的真核生物核心启动子区域(-60bp--10bp)外,还含有多个TATA-box、CAAT-box等启动子元件和多种与脱水、耐盐相关的顺式作用元件,这暗示SpSCL1基因可能参与了海马齿耐盐碱、耐旱的生理过程。运用半定量RT-PCR技术开展了SpSCL1基因表达特征的研究。结果表明,SpSCL1基因为组成型表达,在海马齿根、茎、叶中都有不同程度地表达。0.5MNaCl处理,SpSCL1在根中的表达量逐渐上升,处理后2h达到峰值,之后回落并保持相对较高的水平;20%PEG8000处理后1-2h,SpSCL1基因的表达没有明显的变化,4h时急剧上升并随之回落至正常水平。这些结果说明,SpSCL1基因的表达可能受到盐胁迫和干旱胁迫的诱导并参与了海马齿耐盐的生理途径。成功构建了SpSCL1基因酵母表达载体,并将其转入毕赤酵母中进行耐盐性实验。结果表明,在含有不同浓度的NaCl的BMMY培养基中,转SpSCL1基因的酵母菌的生长速度都明显快于转空载体的酵母菌。在含有1M、1.5M NaCl的YPD平板培养基上,转SpSCL1基因的酵母菌生长速度明显快于转空载体的酵母菌,且菌体数目明显多于转空载体的酵母菌。这些结果说明,SpSCL1基因能够赋予酵母菌较强的耐盐能力。成功构建了SpSCL1基因植物表达载体并获得了转SpSCL1基因的转基因烟草。耐盐、耐旱性实验结果显示,0.2M NaCl或20%PEG8000处理后一周,转基因烟草的生长状况明显优于非转基因烟草;盐和生理干旱胁迫下,转基因烟草基本上能够正常生长,而非转基因植株却表现出明显的萎焉、叶片变黄、生长缓慢等症状。这表明,SpSCL1基因赋予了烟草较强的耐盐、耐旱能力,其过量表达提高了烟草的耐盐、耐旱性。转基因酵母菌和转基因烟草试验初步证实,SpSCL1基因参与了海马齿耐盐、耐旱的生理过程,以SpSCL1为目的基因通过转基因技术可以提高植物耐盐和耐旱的能力。
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