目的:旨在研究psBBOX与底物γ-BB相互作用机制,探究psBBOX的底物范围,确证底物结合位点,通过半理性设计调整底物范围。方法:同源建模和分子对接分析psBBOX与γ-BB的相互作用,以分子对接结果指导底物拓展方向,底物拓展结果反证对接结果。基于底物拓展和分子对接结果,选取psBBOX活性中心附近的氨基酸残基进行定点突变,构建突变体,通过比较突变体和野生型对底物的转化率,分析氨基酸残基位点在底物结合中起到的作用。最后根据突变体的特征,选择性地筛选突变体能够催化的底物类型。结果:共筛选出7个psBBOX新底物,选取转化率最高的新底物4进行放大酶反应,纯化得到产物4a,并对产物结构进行了表征。选取对接结果活性中心7个氨基酸残基,构建15个psBBOX突变体。188A、198A、198D、201A、212E、299A、299Q、368A转化率相比野生型显著下降（＜20%）。184W、184Y、188W、188Y、201F、212A、212M与野生型转化率相当或有轻微降低（55%～85%）。188A突变体可以催化底物类似物7、8进行羟基化反应,通过放大、纯化对产物7a、8a的结构进行表征。结论:底物γ-BB上的季铵基团和羧基基团对于底物结合具有重要作用。7个氨基酸残基位点184、188、201、368、198、212、299都位于活性中心附近。γ-BB的季铵阳离子通过“阳离子-π”相互作用结合在Phe184、Phe188、Tyr201、Tyr368组成的“芳香笼”中。“芳香笼”对底物类似物季铵基团具有一定的空间限制,因此,psBBOX对于大体积季铵阳离子类似物催化活性低。将188位苯丙氨酸突变为丙氨酸后,188A突变体可以接受大体积季铵阳离子作为底物7和8进行羟基化反应。Ser198可能是一个相对保守的氨基酸残基位点,氨基酸结构较小的改变会导致转化率的显著下降,甚至失去催化活性,可能在催化过程具有重要作用。Leu212、Leu299是底物羧基附近的氨基酸残基,Leu212的烷基链变化对γ-BB的转化率影响较小,提示212位是一个可以改造的位点。Leu299的烷基链对底物转化较为重要。