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芽孢杆菌B44是从新疆棉花根际土壤中分离获得,该菌对多种土传植物病原菌均表现出很强的抑菌活性;在田间条件下,该菌对棉苗立枯病、棉花黄萎病以及加工番茄根腐病害表现出了较好的防治效果。为了进一步确定芽孢杆菌B44的种类及其防治棉苗立枯病的生防机理:本研究采用gyr A基因分析以及全基因组测序确定B44的分类地位,采用脂肽类抗生素特异性引物扩增以及RP-HPLC分析和MALDI-TOF-MS鉴定确定了B44产生的脂肽类抗生素的种类;通过特异性引物克隆到了与iturin A合成相关的itu C基因,并通过同源重组的方法敲除了该基因,明确了itu C基因对iturin A生物合成的重要影响,确定了iturin A是B44菌株防治棉苗立枯病的关键性的脂肽类抑菌活性物质;采用单因素和正交设计分析了不同碳源、氮源和无机盐对B44菌株生物量和iturin A产量的影响,通过盆栽和小区试验探讨了B44菌株防治棉苗立枯病的生防机理。研究结果如下:1.由于萎缩芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌菌生长性状的高度相似性往往引起二者的混淆,16S r RNA基因作为传统的细菌分子鉴定法,但是它往往受限于亲缘关系较近的芽孢杆菌变种间的分类,因而前期工作将该菌归为枯草芽孢杆菌,并命名为Bacillus subtilis S44。本研究通过gyr A基因构建系统发育树和全基因组序列与NCBI基因库比对分析进一步确定该菌株的分类地位,确定Bacillus subtilis S44为萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus),并更名为Bacillus atrophaeus B44。2.本研究采用脂肽类抗生素特异性引物从B44菌株扩增到mycosubtilin、fengycins、plipastatins、surfactins和iturin A五种脂肽类型。进一步通过MALDI-TOF-MS分析该菌株的脂肽粗提物,样品中出现的m/z分别为1028.5、1058.8、1106.4、1121.4、1463.7、1477.7和1505.8。通过与报道的脂肽类抗生素m/z比对和分析,结果表明B44菌株可产生C13-iturin A,C18-mycosubtilin,C15-surfactin,C16-fengycin A和C16-fengycin B和m/z为1106.4未知的脂肽类抗生素。3.本研究从B44菌株中扩增出itu C基因片段,并将其克隆到p UC19质粒上,再通过tet基因插入到含有itu C基因片段的p UC19质粒上,将此重组质粒转化到野生菌株中通过含有tet的培养基上筛选突变子。测定itu C突变株和野生菌株iturin A的产生量以及对棉立枯病的的生物防效。结果表明:itu C突变株iturin A的产生量比野生菌株下降了75.9%,通过MALDI-TOF-MS分析,未检测到iturin A,而fengycin和surfactin相对丰度值也显著下降;对立枯病的盆栽防效表明,itu C突变株的平均生物防效为18.8%,比野生菌株的生物防效(47.6%)下降了60.5%。由此表明itu C对iturin A合成产生重要影响,同时也表明iturin A是该菌株对棉立枯病发挥生物防效的关键性抑菌活性物质。4.通过iturin A的RP-HPLC定量分析和平板抑菌活性测定,分别以不加碳源、不加氮源和不加无机盐的NA培养基为对照。结果表明:α-乳糖、果糖、玉米粉iturin A产生量显著性较高,葡萄糖、麦芽糖、半乳糖和蔗糖iturin A的产生量较低,蔗糖的产生量最低,可溶性淀粉、d-木糖对iturin A产量增加影响不显著;Iturin A产量较高的氮源是KNO3,而Na NO3和豌豆粉对iturin A产量增加影响不显著,其它氮源Ca(NO3)2、NH4NO3、酵母提取物、NH4Cl、(NH4)2SO4和尿素的iturin A产量均为下降,尿素的产生量为最低;Mn SO4、Ca CO3和Cu SO4对iturin A产量有显著的促进作用,Mg SO4对iturin A产量增加无显著性影响,而Zn SO4、KH2PO4、KCl和Fe SO4对iturin A产量均具有抑制作用,Zn SO4产生的iturin A产量最低。研究表明B44菌株抑菌活性与iturin A的产生量表现为显著性或极显著性相关。由正交实验得到最高iturin A产量为204.3 mg/L,其正交优化组合包括玉米粉为10 g/L,豌豆粉5 g/L,果糖为10 g/L,KNO3为10 g/L,Mn SO4为0.05 g/L,Mg SO4为1.0 g/L。5.通过B44菌株不同营养发酵液对棉苗立枯病的盆栽和小区防效实验,研究表明该菌株生物防效与iturin A产生量密切相关。同时检测到该菌株能够产生赤霉素和嗜铁素,且促生作用较强的发酵液可能与菌株产生较高浓度的赤霉素有关。通过单因素与正交优化组合发酵液处理对棉立枯病的生物防效测定,正交优化组合的盆栽防效达到72.8%,比单因素KNO3发酵液提高了10.2%,正交优化组合的田间防效为62.6%,比单因素KNO3发酵液提高了9.1%。通过对棉苗SOD、POD和CAT诱导防御性酶酶活测定,发现相对防效较高的处理酶活活性显著较高。由此表明该菌株生防机理还与促生和诱导抗性有关。