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水稻细菌性条斑病(简称条斑病)是由条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. Oryzicola, Xoc)引起的,是水稻生产上危害严重的细菌病害之一。迄今尚未发现对条斑病菌免疫的水稻材料,也未从水稻中鉴定出控制条斑病的主效抗病基因。这一现象可能是由于条斑病菌中存在一个或多个依赖三型分泌系统的抑制因子,能够抑制水稻防御基因产生的抗性。解析这些抑制因子的作用机理将有望破解水稻上缺失对条斑病主效抗性基因的谜题,对研发控制水稻条斑病危害的措施具有指导意义。为了克隆条斑病菌中的抑制因子,本研究构建了条斑病菌小种RS105的全基因组文库,并将文库质粒转化至白叶枯病菌PXO99A中,在水稻抗性材料IRBB21上筛选病斑变长的感病克隆。对筛选到的感病克隆进行测序发现,其中2个克隆的插入片段携带有一个共同的三型效应分子——AvrRxo1。进一步研究发现,转有pHM1: avrRxo1的PXO99A在IRBB21上的致病性显著高于对照PXO99A (pHM1),说明效应分子AvrRxo1具有抑制因子的功能。与野生型条斑病菌RS105相比,avrRxol敲除突变体RS105△avrRxo1在成株期水稻上的致病力显著降低,而突变体回复菌株致病力得到恢复,表明效应分子AvrRxo1在条斑病菌侵染水稻的致病过程中发挥着毒性因子的作用,有利于条斑病的发生。为了明确效应分子AvrRxo1在条斑病菌致病过程中发挥毒性因子的作用机制,本研究采用酵母双杂交技术筛选到与AvrRxo1互作的水稻蛋白OsPDX1.2。OsPDX1.2为OsPDX1蛋白家族成员,该蛋白家族中的另两个成员——OsPDX1.1和OsPDX1.3,与OsPDXl.2在氨基酸序列上高度相似,经酵母双杂交验证发现,OsPDX1.1和OsPDX1.3也可以与AvrRxo1相互作用。采用双分子荧光互补实验和免疫共沉淀实验验证AvrRxo1与OsPDX1蛋白间互作的真实性。实验同时发现,AvrRxo1与OsPDXl蛋白各自的羧基端在该相互作用发挥着不可或缺的作用。另外,实验证明,OsPDX1家族蛋白成员自身和相互之间存在互作。此外,AvrRxo1也可以与拟南芥中AtPDX1蛋白家族成员及酵母中PDX1的同源蛋白SNZ1相互作用。这些结果表明,效应分子AvrRxo1可以与水稻(单子叶植物)、拟南芥(双子叶植物)、酵母(真菌)中的PDX1蛋白互作。与野生型对照相比,超量表达OsPDX1的转基因水稻对条斑病菌表现抗性,OsPDX1-RNAi转基因植株和敲除突变体对条斑病菌表现为更加感病,表明OsPDXl正向调控水稻对条斑病的抗性。研究发现,接种条斑病菌野生型菌株或突变体回复菌株能降低水稻中OsPDX1蛋白水平,而接种avrRxo1敲除突变体RS 105△avr Rxo1的水稻中OsPDX1蛋白水平与对照相比没有显著差异,暗示AvrRxo1可能具有蛋白酶活性。采用无细胞蛋白降解实验和原核表达纯化蛋白实验进一步证实AvrRxo1具有蛋白酶活性,能够降解OsPDX1蛋白。在拟南芥中诱导avrRxo1基因表达能够降低PDX1蛋白的水平。同时,研究发现AvrRxo1降解OsPDX1是依赖ATP的。PDX1在真菌和植物中的功能高度保守,参与维生素B6的从头合成。本研究发现,在本氏烟中瞬时表达avrRxo1基因能够降低本氏烟中维生素B6的水平。在水稻上接种条斑病菌野生型菌株或突变体回复菌株能够降低水稻叶片中维生素B6的水平,而接种avrRxo1敲除突变体RS 105△avrRxo1的水稻中维生素B6的水平与对照相比无显著差异。体外用维生素B6对水稻进行处理能够提高水稻对条斑病菌的抗性。综上,AvrRxo1可以通过降解PDX1蛋白影响植物中维生素B6的从头合成,从而利于条斑病的发生。AvrRxo1能够被非寄主抗性基因Rxol识别,并引起过敏性坏死反应。分析Rxol转基因水稻在接种条斑病菌后OsPDX1基因的表达情况发现,与野生型水稻材料相比,Rxol转基因水稻中OsPDX1.3转录水平显著提高。烟草瞬时表达实验结果证明,Rxol和avrRxo1共表达时能够诱导OsPDXl.3基因启动子驱动的绿色荧光蛋白的表达,而avrRxo1或Rxo1单独表达并没有此功能。酵母双杂交实验证实Rxo1蛋白可以直接与AvrRxo1蛋白互作,在烟草中共表达时Rxo1能够促进AvrRxo1蛋白进入细胞核。结合生物信息学预测结果,在OsPDx1.3基因的启动子上鉴定了一个顺式作用元件S000465,该顺式作用元件在AvrRxo1激活OsPDX1.3基因表达过程中发挥着重要作用。将S000465顺式作用元件与35Smini基础启动子融合来驱动GFP基因,同样可以被AvrRxo1诱导表达。酵母单杂交实验、凝胶阻滞实验证实了AvrRxo1蛋白与S000465元件间的相互作用。综上,在抗性基因Rxol存在的情况下,AvrRxo1蛋白的亚细胞定位发生变化,结合OsPDX1.3基因的启动子,激活OsPDX1.3基因表达,可能促进维生素B6的从头合成,对条斑病表现抗性。在利用酵母双杂交系统筛选互作蛋白时发现,AvrRxo1对酵母细胞具有毒性,而在培养基中添加维生素B6能够解除AvrRxo1的毒性。本研究分别在氨基端和羧基端对AvrRxo1蛋白进行荧光蛋白标记时也发现：当在氨基端标记荧光蛋白后,AvrRxo1对拟南芥细胞的毒性消失,而在羧基端进行荧光蛋白标记的AvrRxo1蛋白对拟南芥细胞仍具有毒性,转基因拟南芥根的伸长受到抑制。分析二者的亚细胞定位发现,YFP-AvrRxo1定位于细胞核中,而AvrRxo1-GFP定位于细胞膜上。在培养基中添加维生素B6可以解除AvrRxo1-GFP拟南芥受到的生长抑制,恢复AvrRxo1-GFP转基因植株根的伸长。这些研究结果表明,AvrRxo1发挥毒性功能可能与其降解PDX1影响维生素B6水平有关,毒性功能的发挥依赖其细胞膜定位。