【摘 要】
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活性小分子未知靶点的发现是其进一步开发的重要环节。目前,基于定量同位素标记和高分辨质谱的“靶点钩钓”技术在小分子化合物靶点发现中得到了广泛的应用。本论文首先对实验室合成的2-取代-6-（6-（4-氨基哌啶-1-基）-吡啶-3-基）-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶衍生物（XWJ-16系列化合物）进行了肿瘤细胞毒测试,并初步探讨了该类化合物的构效关系;然后对筛选得到的代表化合物XWJ-1601进行了体
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活性小分子未知靶点的发现是其进一步开发的重要环节。目前,基于定量同位素标记和高分辨质谱的“靶点钩钓”技术在小分子化合物靶点发现中得到了广泛的应用。本论文首先对实验室合成的2-取代-6-（6-（4-氨基哌啶-1-基）-吡啶-3-基）-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶衍生物（XWJ-16系列化合物）进行了肿瘤细胞毒测试,并初步探讨了该类化合物的构效关系;然后对筛选得到的代表化合物XWJ-1601进行了体内外抗肿瘤活性及抗癌机制的初步研究;最后基于“靶点钩钓”技术（BAS）和“蛋白靶向降解”技术（PROTAC）初步研究了 XWJ-1601可能的靶点结合谱,并对部分重要的靶点进行了验证。论文主要取得了如下成果:（1）XWJ-16系列化合物的肿瘤细胞毒实验发现:该类化合物对肿瘤细胞的增殖具有明显的抑制活性,并且对HepG2和A498的增殖抑制率优于MCF-7;另外,苯基取代位置对化合物活性影响较大。（2）代表化合物XWJ-1601的体内外抗肿瘤活性实验发现:XWJ-1601对肿瘤细胞HepG2的IC50为363.4±7.4 nM;在小鼠肝癌HepG2移植瘤模型中,XWJ-1601在25 mg/kg的用药浓度时可显著抑制肿瘤的生长,但对小鼠肝脾功能没有明显毒性。（3）代表化合物XWJ-1601抗癌机制研究表明:XWJ-1601可以时间依赖性和浓度依赖性的方式下调肝癌潜在治疗靶点RARγ;XWJ-1601可诱导HepG2细胞阻滞于G2-M期,下调抗凋亡蛋白BCl-2以及诱导PARP的切割。基于XWJ-1601对HepG2细胞全蛋白组干预作用的研究表明,XWJ-1601可能通过上调MAPK激酶功能或通过下调POLR2A等基因参与的转录过程,进而阻滞了细胞进程,从而加速细胞的凋亡。（4）代表化合物XWJ-1601潜在靶点发现中:通过肿瘤细胞毒实验、合成筛选到了较合适的 BAS 和 PROTAC 功能分子 XWJ-1601-Biotin 和 XWJ-1601-PO-4;BAS和 PROTAC 两种策略发现 CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、CDK9、CDK12、EGFR、CDC20等是XWJ1601的潜在靶点。（5）代表化合物XWJ-1601潜在重要靶点验证中:①XWJ-1601-Biotin可以富集CDK9、EGFR等蛋白,且其可以被XWJ-1601部分竞争;②并且55 Kd处的质谱确定CDK9是XWJ-1601的靶点;③XWJ-1601-PO-4可下调CDK9、EGFR的蛋白表达水平;④激酶活性实验的结果表明XWJ-1601可以浓度依赖性的抑制EGFR激酶活性,其IC50=6.8μM,但XWJ-1601对CDK9的激酶活性没有影响,推测XWJ-1601并不是直接影响CDK9的激酶活性,而是通过蛋白-蛋白相互作用来调控CDK9。综上,XWJ-1601是EGFR的激酶抑制剂和CDK9的小分子配体。因此,XWJ-1601可以作为肝癌治疗的苗头化合物,在已有的生物数据基础上,将进一步确定靶点结合谱,根据XWJ-1601的作用靶点和作用机制,明确可能的毒副作用,为1H-咪唑并[4,5-b]吡啶衍生物的成药性提供实验基础。
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