论文部分内容阅读
目的：阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种原发性神经退行性病变,其病理学特征为淀粉样蛋白(Amyliod-protein,Aβ)沉积形成老年斑(senile plaques, SPs)、神经元内神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFTs)以及特有的中枢胆碱能神经元的大量死亡及丢失等。大脑内的Aβ的产生和降解机制失衡是现在比较公认的阿尔茨海默症的发病机制。中药复方的研究虽然有多靶点的治疗优势,但不能清楚说明参与疾病机制调控的作用靶点,而中药单体研究的优势则更加突显。中医学认为阿尔茨海默病最主要的发病机制与肾虚有关。因此,本实验选取临床常用的补肾要药的有效单体成分——巴戟甲素(巴戟天提取物),女贞苷(女贞子提取物),淫羊藿苷(淫羊藿提取物)进行筛选,并探讨对AD模型的有保护作用的补肾单体的可能作用机制。方法1.筛选淀粉样蛋白Aβ42对人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞最佳的损伤浓度,然后建立稳定的细胞损伤模型。2.分别在小鼠脑内皮细胞(EC)和SH-SY5Y细胞上筛选出补肾中药单体巴戟甲素、女贞苷、淫羊藿苷合适的作用浓度,并进行后续实验。3.通过MTT法检测细胞活力及显微镜下观察细胞形态变化,从以上三种中药单体中筛选出对A β 42诱导的SH-SY5Y细胞神经毒性有保护作用的单体。4.选择有效的补肾中药单体,对其保护机制进行探讨。4.1巴戟甲素对AD模型保护作用的机制探讨4.1.1巴戟甲素对Aβ 42诱导的SH-SY5Y细胞保护作用的机制探讨：巴戟甲素作用于细胞12h,免疫印迹法检测其对细胞低密度脂蛋白受体1(LRP1),淀粉样前体蛋白(APP)的影响,实时荧光定量PCR检测SH-SY5Y细胞LRP1 mRNA表达的变化。巴戟甲素分别作用于正常的SH-SY5Y细胞和Si LRP1 SH-SY5Y细胞后,加入Aβ42,用Elisa法分别检测胞内胞外的Aβ42变化水平,激光共聚焦观察随时间变化Aβ42进入细胞及与溶酶体共定位的情况。4.1.2巴戟甲素对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠模型的影响：选择7月龄的SPF级雄性APPswe/PS1dE9双转基因小鼠58只(品系名称：B6C3-Tg(APPswe, PSEN1dE9) 85Dbo/J(简称：APPSWe/PS1dE9),相同背景的非转基因小鼠C57BL/6J。双转基因小鼠随机分为模型组、巴戟甲素低剂量(20mg/kg)组、巴戟甲素高剂量(80mg/kg)组,每组10只；同背景非转基因C57BL/6J小鼠作为野生对照组,每组10只；灌胃处理1个月。给药结束后取小鼠海马组织,用Western blot检测其LRP1的表达。4.2女贞苷对A β 42诱导的SH-SY5Y细胞保护作用的机制探讨：女贞苷作用SH-SY5Y细胞后加入Aβ42,用Elisa法检测胞外的Aβ42含量,免疫印迹法检测NF-KB, Bcl-2,LC3蛋白变化。实验结果：1.使用不同浓度的Aβ42 (5μmol·L-1、10μmol·L-1、15μmol·L-1、20μmol·L-1、40 μmol·L-1)损伤SH-SYSY细胞,各组细胞活力均降低,均有统计学意义(P<0.05)。但5μmol·L-1、10μmol·L-1损伤SH-SYSY细胞的作用不够强,15μmol·L-1、20μmol·L-1、 40μmol·L-1均可以损伤的条件下,则选择最小剂量的15μmol·L-1 Aβ42作为最佳浓度进行后续的实验。2.在人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y上筛选巴戟甲素、女贞苷、淫羊藿苷合适的用药浓度,结果表明巴戟甲素、女贞苷、淫羊藿苷浓度达到500μmol·L-1时,对细胞活力无明显影响(P>0.05)。将巴戟甲素、女贞苷再次作用于更为敏感小鼠脑微血管内皮细胞进行筛选,实验结果表明巴戟甲素、女贞苷浓度小于500μmol·L-1时,对内皮细胞活力亦无明显影响(P>0.05)。3.淫羊藿苷浓度为5、50、500μmol·L-1时,对Aβ42诱导的SH-SY5Y细胞神经毒性的对细胞活力无明显影响,差异无统计学意义(P>0.05),说明淫羊藿苷对该AD模型没有明显的保护作用,后续的机制探讨实验不予选取。4.巴戟甲素对Aβ42诱导的SH-SY5Y细胞的保护作用及机制探讨4.1巴戟甲素的浓度为50、100、500μmol·L-1时,对Aβ42诱导的SH-SY5Y细胞损伤均有保护作用(P<0.05)。4.2巴戟甲素保护作用初步的机制探讨4.2.1巴戟甲素作用于SH-SY5Y细胞12h后,与正常组比较,巴戟甲素组(50、100μmol·L-1)细胞膜转运蛋白LRP1的蛋白表达明显增加(P<0.05),淀粉前体样蛋白(APP)表达无明显变化(P>0.05)。Elisa检测细胞胞内及条件培养基中Aβ42的含量,结果显示巴戟甲素可以有效增加SH-SY5Y细胞对Aβ42的清除作用,与模型组条件培养基Aβ42含量比较,巴戟甲素(50、100μmol·L-1)组条件培养基的Aβ42含量相对减少(P<0.05)；与模型组胞内Aβ42含量比较,巴戟甲素组(50μmol·L-1)胞内的Aβ42含量相对增加(P<0.05),巴戟甲素组(100μmol·L-1)胞内的Aβ42含量差异不明显(P>0.05)。激光共聚焦的结果显示根据时间点的不同,在30 min时与对照组相比,巴戟甲素组中的A β 42进入SH-SY5Y细胞的较多。随时间增加,在60min时,巴戟甲素组内吞A β 42多于模型组,但此时A β 42与溶酶体的无共定位。在120min时,对照组开始出现少量的Aβ 42与溶酶体的共定位；与之相比,巴戟甲素组的细胞内出现的A β 42与溶酶体的共定位要更多。4.2.2基因干扰LRP1进行反向论证：巴戟甲素同时作用在正常的SH-SYSY细胞和SiLRP1的SH-SY5Y细胞上,Elisa检测模型组、巴戟甲素组胞内及条件培养基Aβ42的含量。结果显示与模型组条件培养基比较,巴戟甲素组的条件培养基Aβ42的含量无明显差异(P>0.05)；与正常SH-SY5Y细胞模型组Aβ42的含量相比,Si LRP1的SH-SY5Y细胞胞外Aβ42含量明显增高(P<0.05)；与正常SH-SY5Y细胞巴戟甲素组比较,Si LRP1细胞的巴戟甲素组胞外Aβ42的含量也明显增加(P<0.05)。基因沉默组中的巴戟甲素的两个用药组和模型组相比,虽有降低的趋势,但是差异无统计学意义(P>0.05)。4.2.3转基因小鼠灌胃1月,取其海马区的组织用Western blot法检测其LRP1蛋白表达,发现巴戟甲素组的LRP1表达与正常组和模型组的蛋白表达并未见明显差异(P>0.05)。5.女贞苷对Aβ42诱导的SH-SY5Y细胞的保护作用及机制探讨5.1女贞苷的浓度为50、100μmol·L-1时,对Aβ42诱导的SH-SY5Y细胞神经毒性的均有保护作用,可明显增加细胞存活率,差异有统计学意义(P<0.05)。显微镜下观察Aβ42模型组与正常对照组细胞比较,正常对照组细胞生长良好,树枝状轴突明显,细胞透亮；模型组细胞形态边缘模糊,细胞皱缩,轴突消失；与模型组比较,女贞苷两个用药组细胞凋亡明显减少。5.2初步机制探讨：女贞苷作用SH-SY5Y细胞后,Western blot检测自噬小体标记物LC3,结果表明模型组LC3 JI/LC3 I相对表达量与正常组相比明显增加(P<0.05),与模型组相较,女贞苷组(50、100μmol·L-1)的LC3 Ⅱ/LC3 I比值明显减少(P<0.05)；NF-κB蛋白表达与模型组比较,检测女贞苷组(50、100μmol·L-1)的明显减少(P<0.05),抗凋亡因子Bcl-2蛋白的表达则明显增加(P<0.05)。女贞苷同时也能增加SH-SY5Y细胞对Aβ42的清除,Elisa检测结果显示,与模型组条件培养基的Aβ42含量比较,女贞苷组(50、100μmol·L-1)的Aβ42含量均下降。结论：1.淫羊藿苷对Aβ42诱导SH-SY5Y细胞神经毒性损伤没有明显保护作用。2.巴戟甲素可以保护Aβ42诱导SH-SY5Y细胞神经毒性损伤,其可能机制是巴戟甲素作用于SH-SY5Y细胞可有效增加人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的跨膜转运蛋白LRP1的表达,增加细胞对Aβ42的转运内吞以及溶酶体对其清除,减少Aβ42在胞外的沉积从而降低Aβ42产生的细胞毒性,起到保护神经元的作用。在转基因小鼠脑内的海马区却未见LRP1蛋白表达明显增加可能由于选择的动物模型与细胞模型作用机制不一致引起的。3.女贞苷可以保护Aβ42诱导SH-SY5Y细胞神经毒性损伤,可以有效增加细胞对Aβ42的转运和清除,对自噬有一定的抑制,抑制NF-κB的蛋白表达和增加抗凋亡因子Bcl-2蛋白的表达,可以起到保护神经元的作用,抑制神经元的凋亡。