淫羊藿苷（Icariin,ICA）是中草药淫羊藿最主要的黄酮类有效成分,能增加骨质疏松大鼠的骨矿化密度、生物机械强度及骨小梁的粗度,其成骨效应可与雌激素（Estrogen,E2）相媲美。随着医学研究的广泛深入,中药的应用逐渐引入口腔正畸学的领域。本课题组前期研究将ICA应用于大鼠快速扩弓动物模型中发现ICA能促进扩弓区骨质改建,加速新骨形成,但其内在成骨机制有待进一步阐明。趋化因子受体 4（CXC motif chemokine receptor type 4,CXCR4）是一种 G 蛋白偶联的趋化因子受体,与基质细胞衍生因子-1（Stromal cell-derivedfactor-1,SDF-1）结合形成的SDF-1/CXCR4信号轴不仅在干细胞动员、归巢中发挥作用,而且其本身对间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）成骨分化发挥具有重要作用。CXCR4缺失阻碍成骨细胞成熟,抑制骨的生长和发育,表现为骨小梁和皮质骨量减少、骨矿物质密度的降低等。Guang等学者研究发现3～23月龄的C57BL/6J野生型小鼠的骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）CXCR4基因和蛋白的表达随着年龄的增长逐渐下降。与年轻小鼠相比,老年小鼠随着CXCR4的缺失表现为碱性磷酸酶（Alkalinephosphatase,ALP）活性降低、骨钙素（Osteocalcin,OCN）合成和钙沉积减少,阻碍老年BMSCs的成骨分化潜能。而过表达CXCR4可以在很大程度上逆转老年小鼠BMSCs成骨分化的受损程度。提示CXCR4对MSCs的成骨潜能至关重要。沉默CXCR4或使用CXCR4特异性受体抑制剂,抑制BMP下游信号通路Smad信号通路,抑制成骨分化早期阶段标志因子如转录因子JunB、Plzf及其下游Runt相关转录因子2（Run-related transcription factor2,Runx2）的转录,下调成骨分化晚期标志分子OCN的表达,同时也阻断MPAKp38信号通路和Erk信号通路的早期成骨分化标志分子Msx2、Dlx5及其下游成骨细胞特异性转录因子（Osterix,Osx）的转录以及ALP的形成。因此CXCR4信号通路参与BMP-2诱导的成骨分化并在其成骨分化中发挥重要作用。我们前期研究显示ICA能通过上调CXCR4的表达,促进rBMSCs向SDF-1α的迁移,由此我们推测CXCR4信号通路是否协同参与ICA诱导的促进细胞成骨分化作用。信号转导和转录激活因子 3（Signal transduction and transcriptional activators 3,STAT3）是一种关键的信号转导蛋白,是JAK-STAT信号通路中的一员,参与多种细胞因子、生长因子和肿瘤蛋白的信号转导,是STAT家族中介导骨质形成与破骨吸收最重要的转录因子,在成骨细胞、骨细胞以及破骨细胞中均有表达。STAT3失活会导致胚胎小鼠骨密度和骨强度的下降。抑制JAK-STAT3磷酸化会阻碍BMP-2诱导的ALP的形成,抑制细胞的成骨分化。cDNA微阵列芯片研究显示在STAT3持续激活的细胞中CXCR4蛋白的表达呈现上调,磷酸化的STAT3进入细胞核与STAT3结合序列（STAT-3-interacting elements,SIE）结合,促进基因的转录,而SIE序列恰好位于CXCR4启动子内。Lim等研究发现在BMSCs中,淫羊藿素,中草药淫羊藿的另一种有效的活性成分,能通过增强p-STAT3与SIE序列的结合而上调CXCR4的表达,从而促进BMSCs的成骨分化。因此我们推测ICA可能通过上调STAT3表达来增强CXCR4蛋白的表达,从而促进ICA对细胞的成骨分化作用。因此本实验通过建立体内、体外实验模型探索ICA促进细胞成骨分化的作用机制,主要包括以下几个部分:（1）在大鼠快速扩弓动物模型基础上,检测ICA促进扩弓区成骨作用并检测CXCR4蛋白的表达。（2）建立rBMSCs体外细胞培养模型,检测ICA对rBMSCs的成骨分化能力的影响,并筛选ICA的最佳药物浓度;（3）构建si-CXCR4并转入rBMSCs中探讨干扰CXCR4对ICA促进成骨分化的作用。（4）通过WB检测ICA对STAT3、p-STAT3蛋白的表达,使用雌激素受体抑制剂ICI182,780检测ICA对CXCR4、STAT3蛋白表达的调节。（5）通过分别干扰CXCR4、STAT3探究CXCR4、STAT3协同参与ICA促进成骨分化的作用机制,为ICA的临床应用提供实验基础。方法1.ICA促进大鼠RME扩弓区CXCR4的表达建立RME动物模型,将24只SD大鼠随机分为对照组（Control组）、单纯扩弓组（OE组）、扩弓+ICA组（IE组）,每组8只。Control组为既不扩弓也不局部注射ICA,仅局部注射含0.01%DMSO的α-MEM溶液;OE组及IE组两组大鼠均在上颌安装二眼圈簧扩弓装置,OE组在扩弓区腭中缝软组织处局部注射含0.01%DMSO的α-MEM溶液;IE组在扩弓区腭中缝软组织处局部注射1μM的ICA溶液,扩弓后7d收集样本。每组随机挑取3只SD大鼠对上颌骨行microCT扫描并重建大鼠上颌骨三维影像,利用软件测量上颌骨腭中缝宽度,明确二眼圈簧扩弓器是否达到扩开大鼠上颌腭中缝的目的;通过测量大鼠腭中缝目标区域骨容积（Bone volume,BV）,评价扩弓后7dICA对腭中缝区的成骨情况;剩余大鼠样本通过HE染色、Masson染色观察扩弓区腭中缝的组织形态;通过CXCR4免疫组化染色及免疫荧光染色检测ICA对RME扩弓区CXCR4蛋白的表达,提出ICA促进大鼠扩弓区CXCR4蛋白的表达,为体外细胞实验奠定基础。2.ICA对rBMSCs成骨分化的影响使用全骨髓贴壁法体外分离、培养rBMSCs,流式细胞仪检测干细胞表面标志记分子CD44、CD45、CD90、CD34鉴定细胞来源;成骨及成脂诱导鉴定干细胞多向分化潜能。使用CCK-8实验检测不同浓度ICA（0.1μM、1μM、10μM）对rBMSCs细胞增殖活性的影响;利用流式细胞仪检测不同浓度（0.1μM、10μM）ICA对细胞凋亡的影响;通过ALP染色及定量检测不同浓度（0.1μM、1μM、10μM）ICA对rBMSCs ALP活性的影响,通过茜素红染色检测不同浓度（0.1μM、1μM、10μM）ICA对细胞体外矿化结节形成能力的影响,检测不同浓度ICA对rBMSCs的成骨分化能力的影响,为后期体外细胞研究提供细胞模型基础,并筛选最佳ICA药物浓度。3.ICA通过CXCR4调节rBMSCs的成骨分化作用利用qRT PCR及WB检测ICA作用细胞的不同时间点CXCR4蛋白的表达;通过构建si-RNA干扰CXCR4并转入rBMSCs中,检测干扰CXCR4对ICA促进rBMSCs增殖的影响;利用ALP活性分析、ALP染色检测干扰CXCR4后,ICA对rBMSCs ALP活性的影响;采用茜素红染色、矿化基质定量分析检测干扰CXCR4后,ICA对rBMSCs矿化结节的沉积的影响;利用qRT PCR以及WB检测干扰CXCR4后,ICA对细胞成骨相关基因Runx2、Col l、OCN的蛋白及mRNA表达的影响,探讨CXCR4在ICA促进rBMSCs成骨分化能力中的作用。4.ICA通过STAT3/CXCR4调节rBMSCs的成骨分化作用利用qRTPCR及WB检测ICA作用的不同时间点p-STAT3、STAT3蛋白的表达;通过雌激素受体抑制剂ICI182,780检测ICA是否通过ER同时调节CXCR4及p-STAT3蛋白的表达;最后部分实验探索CXCR4与STAT3在ICA促进成骨分化过程的协同参与机制。该部分实验通过分别干扰CXCR4与STAT3来探讨两者的相互关系。首先利用si-RNA干扰CXCR4,检测干扰CXCR4对ICA诱导的p-STAT3、STAT3蛋白表达的调节;随后利用si-RNA干扰STAT3、STAT3抑制剂WP1066抑制STAT3的磷酸化的方法检测STAT3对CXCR4蛋白表达的调节,探讨CXCR4对ICA促进rBMSCs成骨分化的作用机制。结果1.ICA促进大鼠RME扩弓区CXCR4的表达动物实验按照课题组前期建立大鼠RME模型的方式成功建立大鼠RME动物模型。在扩弓后7d收集样本后对大鼠上颌骨腭中缝区进行了microCT、HE染色、Masson染色及CXCR4的免疫组化及免疫荧光检测。microCT检测结果显示OE组与IE组（扩弓组）上颌骨腭中缝的宽度,明显较Control组宽,表明快速扩弓动物模型成功建立;通过对腭中缝目标区域BV值检测结果发组BV值较OE组高,IE组扩弓区骨体积较OE组强。HE染色可见Control组大鼠腭中缝区由中央部分的狭长纤维组织带与两侧的软骨细胞带组成,最外侧为腭骨的硬骨板边缘,在硬骨板边缘可见散在的成骨细胞。OE组与IE组扩弓区纤维组织被牵拉伸长,方向与扩弓力的方向一致,软骨细胞带向纤维组织伸展,扩弓区硬骨板的边缘可见成骨细胞数量增多,提示腭中缝区骨改建活跃,其中IE组成骨细胞的数量较OE组多。Masson染色结果显示IE组胶原纤维的蓝染明显较OE组多,综上得出ICA促进扩弓区的成骨作用。免疫荧光及免疫组化染色结果显示IE组扩弓区CXCR4阳性表达较OE组显著增强,提出ICA促进扩弓区细胞上调CXCR4蛋白的表达。2.ICA对rBMSCs成骨分化的影响利用全骨髓贴壁法成功分离培养rBMSCs,流式细胞仪检测干细胞表面标志物CD90、CD44阳性,CD34和CD45阴性,符合细胞表面免疫表型鉴定;成骨及成脂诱导证实体外培养的rBMSCs具有成骨与成脂的多向分化潜能。CCK-8检测结果显示与Control组相比,不同浓度（0.1μM、1μM、10μM）ICA就能促进rBMSCs的细胞增殖,其中1μM ICA促进增殖作用最为显著;细胞凋亡检测结果显示不同浓度（0.1μM、1μM、10μM）ICA对细胞的凋亡无明显影响。ALP染色检测结果显示不同浓度ICA与Control组相比呈现不同程度的深染染色深染,ALP活性检测与ALP染色结果呈现一致性;茜素红染色显示不同浓度（0.1μM、1μM、10μM）ICA矿化结节染色均较Control组深染,矿化结节定量分析与茜素红染色呈现一致性,表明低浓度的ICA（0.1μM、1μM、10μM）促进rBMSCs的成骨分化作用,其中1μM的ICA促进细胞成骨的作用最强。3.ICA通过CXCR4调节作rBMSCs的成骨分化作用首先通过qRT PCR及Western blot检测ICA作用的不同时间点CXCR4蛋白的表达。qRT PCR检测结果显示ICA作用后6h、12h、24h CXCR4 mRNA表达均出现上调,其中12h组mRNA表达量最高。Western blot结果显示ICA作用后6h、12h、24hCXCR4蛋白表达量逐渐增强,表明ICA促进rBMSCs CXCR4蛋白的表达,和体内动物模型表型一致。随后建立si-CXCR4并转入rBMSCs中探索干扰CXCR4对ICA诱导成骨分化的影响。CCK-8检测结果显示,干扰CXCR4后ICA的促进细胞增殖作用与ICA组相比出现明显的下调,提示干扰CXCR4抑制ICA的促进细胞增殖作用。干扰CXCR4后,抑制ICA对促进rBMSCs成骨相关基因ColⅠ、Runx2、OCN的mRNA及蛋白的表达,ALP染色及ALP活性下调,体外矿化结节沉积减少,表明干扰CXCR4阻碍ICA促进细胞的成骨分化的潜能。4.ICA通过STAT3/CXCR4调节rBMSCs的成骨分化作用首先WB检测ICA在不同时间点对STAT3蛋白的表达,并使用雌激素受体抑制剂探索ICA对CXCR4及STAT3蛋白表达的调节。结果显示ICA在作用后的6h、12h、24h p-STAT3的表达逐渐增强,而STAT3基础蛋白的表达量基本不变。加入雌激素受体抑制剂ICI后,抑制了ICA诱导的p-STAT3及CXCR4蛋白的表达,提示ICA能通过ER调节p-STAT3 与 CXCR4 表达。随后我们集中探讨CXCR4与STAT3在ICA成骨分化过程中的协同参与机制。首先,建立si-CXCR4干扰细胞模型,检测干扰CXCR4对ICA诱导的STAT3、p-STAT3蛋白表达的调节,以探讨ICA是否通过CXCR4调节STAT3蛋白的表达。结果显示干扰CXCR4后ICA诱导的CXCR4表达出现相应的降低,但ICA诱导的STAT3以及p-STAT3蛋白的表达并没有出现相应地下调,提示CXCR4可能不参与ICA对p-STAT3及STAT3蛋白表达的调控。其次,建立si-STAT3干扰细胞模型,检测干扰STAT3对ICA诱导的CXCR4蛋白表达的调节,结果显示干扰STAT3后,ICA诱导的p-STAT3及STAT3蛋白表达出现明显的降低,相应的CXCR4蛋白的表达也出现显著的下调,提示ICA诱导rBMSCs的成骨分化过程中,STAT3参与对CXCR4蛋白的表达调控;同时使用STAT3的磷酸化抑制剂WP1066结果发现,WP1066抑制p-STAT3蛋白表达的同时,也阻碍了 ICA诱导的CXCR4蛋白的表达,因此我们得出在rBMSCs中ICA通过p-STAT3调节CXCR4蛋白的表达。为了验证我们获得的实验结果,我们利用WP1066检测p-STAT3对ICA促进成骨向分化潜能的检测,结果发现WP1066抑制了ICA对rBMSCs的促细胞增殖作用,阻碍了成骨相关基因Runx2、ColⅠ、OCN蛋白的表达上调,降低ALP的活性,减少了矿化结节的沉积,进一步证明ICA通过STAT3/CXCR4促进rBMSCs的成骨分化潜能。结论1.ICA促进大鼠RME扩弓区的成骨作用,上调CXCR4的表达。2.低浓度ICA（0.1μM、1μM、10μM）促进rBMSCs的成骨分化。3.ICA通过CXCR4调节rBMSCs成骨分化作用。4.ICA促进rBMSCs的成骨分化过程中,STAT3参与对CXCR4蛋白的表达调控。