肺癌是死亡率最高的恶性肿瘤之一,约占全球各类肿瘤死亡率的25%,其中约75%的肺癌患者为非小细胞肺癌（NSCLC）。肺癌发病率和致死率持续升高,且治疗靶点有限,因此进一步揭示肺癌发生发展的分子机制并寻找更多有效的治疗靶点对肺癌病人的诊断治疗及预后具有重要的指导意义。能量代谢重编程是肿瘤细胞的一个典型特征。即使在氧气充足的情况下,肿瘤细胞依然主要依靠糖酵解代谢提供能量,这种现象被称为有氧糖酵解或Warburg效应。肿瘤细胞内能量代谢的改变不仅可为其提供充足的能量,而且产生必要的代谢中间产物,以满足肿瘤细胞快速生长和转移的需要及避免其凋亡。越来越多的研究表明,糖酵解代谢酶的表达水平或其活性在肿瘤细胞中的特异性调控对于维持高水平的有氧糖酵解及促进肿瘤的发生发展是非常关键的。因此,深入了解代谢酶调控有氧糖酵解、介导肿瘤发生发展的分子机制,对寻找NSCLC新药物靶点具有重要意义。磷酸丙糖异构酶（TPI）作为其中一种糖酵解代谢酶,通过催化磷酸二羟丙酮（DHAP）和D-甘油醛-3-磷酸（GAP）之间的可逆转化,在糖酵解过程中发挥重要的催化功能。DHAP和GAP都是由醛缩酶催化1,6-二磷酸果糖分解产生,但只有GAP可进入糖酵解下游的代谢反应,因此,这两种代谢产物之间的异构转化提高了糖酵解效率。研究发现,TPI在许多肿瘤组织中高表达,像食道癌,肺癌,胃癌等。另外TPI表达缺失抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭,诱导细胞凋亡和在G2/M期的阻滞。然而,关于TPI酶,尤其TPI的蛋白质翻译后修饰在肿瘤中的特异性调控依然需要更多研究。蛋白翻译后修饰（Post translation modification,PTM）是指蛋白质氨基酸侧链上小分子基团的共价结合,包括磷酸化、乙酰化、甲基化和糖基化修饰等,除了这些常见的已知修饰外,更多的未知修饰也有待进一步探究。PTM通过改变蛋白质的结构、活性、定位及互作关系可特异性的调控蛋白质功能,参与各种生理、病理过程,包括肿瘤的发生、发展和预后,也与肿瘤的诊断和治疗密切相关。近年许多研究发现蛋白修饰可通过改变代谢酶结构或其催化活性进而直接调控糖酵解代谢以在肿瘤发生发展中发挥重要作用,因此,系统分析糖酵解代谢酶的蛋白修饰及其在非小细胞肺癌中的变化将有助于进一步阐明代谢酶对肿瘤特异性调控的分子机制。在本研究中我们对非小细胞肺癌蛋白组中所存在的潜在蛋白修饰进行分析,尤其糖酵解代谢酶,并且进一步探究TPI Ser58磷酸化修饰通过调节糖酵解代谢促进肺癌发展的作用及机制研究。第一部分肺癌组织中糖酵解代谢酶存在多种蛋白修饰[目的]我们利用一个基于鸟枪法蛋白组学的高通量质谱工作流程,在NSCLC病人的肿瘤及其邻近癌旁组织蛋白组水平上鉴定实际氨基酸残基和编码氨基酸理论分子量之间的差值（deltamass）,即代表该蛋白位点存在的潜在蛋白修饰。接下来统计分析各种delta mass cluster的总丰度在肺癌中的整体变化,另外对蛋白各位点所发生的可能修饰在肺癌中的变化及发生差异修饰的蛋白所富集的通路进行生物信息学分析,最后我们重点对糖酵解代谢酶所鉴定到的各种可能蛋白修饰进行了详细分析,初步明确蛋白修饰在肺癌中的特异性变化,为进一步探究PTMs通过介导代谢酶功能进而调控肿瘤发生发展的机制奠定基础。[方法]1.收集非小细胞肺癌病人的肿瘤及其邻近癌旁组织,提取蛋白,胰酶（Trypsin）酶解,收集肽段且利用液相分级,通过LC-MS/MS技术对肽段进行鉴定分析。2.将质谱数据利用Byonic软件匹配人类蛋白质数据库Uniprot（20171020）进行搜库分析,计算非零质量差（delta mass＞0.01）,即蛋白中某位点实际氨基酸和编码氨基酸理论分子量之间的差值。将鉴定到的所有delta masses划分为在n-0.5至n+0.5 Da（n=-200至1000）范围内具有1 Da间隔的亚组,使用高斯混合成分的多变量聚类分析每个质量窗口中的质量差,聚类分析得到每种质量差均值（delta mass cluster）,即代表发生于各蛋白位点的潜在修饰,同时分析各质量差值与Unimod数据库中已知修饰的分子量是否匹配。3.统计分析各种delta mass cluster的总丰度,且比较其在肺癌及癌旁组织之间的整体水平变化。4.通过生物信息学分析比较发生于蛋白各位点的质量差在肺癌和对应癌旁组织之间的丰度变化,并对发生差异修饰的蛋白进行通路富集,明确蛋白修饰在肺癌中的特异性调控。5.对各个蛋白所发生的delta masses的总丰度及其种类进行统计分析,明确哪些蛋白易于被修饰;对糖酵解代谢酶所发生的各种潜在蛋白修饰进行分析,并比较在肺癌和癌旁组织之间的整体水平变化。[结果]1.通过质谱鉴定和分析发现肺癌蛋白组中存在大量和多种delta masses,经高斯回归拟合聚类分析得到319种特异的delta masses,分布于10897个蛋白氨基酸位点,其中一些质量差值与数据库中已知修饰的分子量匹配,未匹配的质量差值代表潜在的未知新修饰。2.对以上319种delta mass clusters的总丰度进行统计分析,发现其中39种质量差的整体丰度在肺癌中显著升高或下降2倍以上（FDR-adj.p value＜0.05）,其中与磷酸化修饰分子量相匹配的+79.967Da分子量偏移在肺癌中整体上调最显著,并且主要发生于蛋白丝氨酸位点。3.通过生物信息学分析发现分别位于257和489个蛋白氨基酸位点的质量差的丰度在肺癌中显著升高和降低2倍以上（FDR-adj.pvalue＜0.05）,且发生差异修饰的蛋白在多种功能通路显著富集,尤其糖酵解通路,提示肺癌中蛋白修饰对糖酵解代谢酶功能的特异性调控。4.对每个蛋白鉴定到的所有delta masses的总丰度和种类分别进行统计排序分析,发现大多数糖酵解代谢酶,尤其GAPDH、ENO1、PKM2及TPI在蛋白组水平排序位置居高。5.多种糖酵解代谢酶中所鉴定到的delta masses丰度在肺癌中呈整体升高趋势。[小结]1.肺癌蛋白组中存在多种可能的蛋白修饰。2.与磷酸化修饰分子量匹配的+79.967 Da质量偏移在肺癌中上调最显著,且主要发生在丝氨酸位点。3.糖酵解代谢酶中存在多种潜在的蛋白修饰,且其许多氨基酸位点的修饰丰度在肺癌及癌旁组织中存在显著差异。第二部分糖酵解代谢酶在肺癌中表达水平普遍升高[目的]第一部分我们发现肺癌蛋白组中广泛存在多种可能的蛋白修饰,接下来进一步通过蛋白组学对蛋白表达水平进行分析。生物信息学分析肺癌中差异表达蛋白及其参与的生物学通路,同时我们将对糖酵解关键酶的表达水平及其与病人预后关系进行详细分析,对探究介导肺癌发生发展的靶蛋白具有重要意义。[方法]1.利用Maxquant软件匹配人类蛋白质数据库Uniprot（20171020）,对第一部分质谱运行完毕的文件进行搜库分析,对得到的蛋白表达数据利用Perseus软件进行log2转换,缺失值填补及标准化处理。2.与癌旁组织比较,计算分析肺癌中蛋白表达水平的变化,同时利用FDR对p值进行校正,另外对得到的肺癌中差异表达蛋白进行通路富集分析。3.进一步分析数据中鉴定到的所有代谢相关蛋白,并通过David数据库对肺癌中差异表达代谢蛋白所参与的生物学过程进行分析。4.通过我们的蛋白组学数据重点分析关键糖酵解酶的蛋白表达水平在肺癌中的变化,同时结合GEO数据库分析其mRNA水平,以及利用KM plotter分析糖酵解代谢酶变化与病人预后的相关性。[结果]1.我们的蛋白组学数据共鉴定到4426个蛋白（FDR＜1%）,数据分析显示肺癌与其邻近癌旁组织的蛋白组整体表达水平存在显著差异。2.统计结果显示634个蛋白在肺癌中表达差异显著（FDR-adj.p＜0.05）,其中418个蛋白表达上调2倍以上,117个蛋白表达水平下降2倍以上;进一步通过KEGG数据库分析发现肺癌中差异表达蛋白在多种代谢通路显著富集,包括糖酵解代谢、碳代谢及丙酮酸代谢。3.生物信息学分析发现101个代谢相关蛋白的表达水平在肺癌中发生显著改变（FDR-adj.p＜0.05）,通过David数据库分析发现这些差异表达代谢蛋白在糖酵解过程显著富集。4.通过蛋白组学数据分析发现糖酵解代谢关键酶的蛋白表达水平在肺癌中普遍升高,同时GEO数据库分析发现其mRNA水平也普遍上调,且其高表达与病人预后呈负相关。[小结]1.肺癌组织与其邻近癌旁组织的蛋白组整体表达水平存在显著差异。2.肺癌中差异表达蛋白在糖酵解代谢通路显著富集。3.关键糖酵解酶的mRNA及蛋白表达水平在肺癌中普遍上调,且其mRNA高表达与病人预后呈负相关。第三部分TPI Ser58磷酸化修饰促进糖酵解代谢和非小细胞肺癌发展[目的]前两部分组学分析结果均揭示了糖酵解代谢在肺癌中的失调,进一步说明代谢重编程在肿瘤发生发展中的重要作用。另外糖酵解代谢酶中被鉴定广泛存在多种潜在的蛋白修饰,这提示蛋白修饰通过介导糖酵解酶功能对肿瘤细胞的特异性调控。因此,我们重点分析糖酵解蛋白所鉴定到的 delta masses,发现TPI@58S@+79.967、GAPDH@313W@+15.995、GAPDH@65G@+1.968的丰度在肺癌中变化最明显。另外,越来越多的研究揭示蛋白激酶信号转导与代谢途径之间的机制关系,表明磷酸化修饰对调节癌细胞代谢和肿瘤发生发展具有重要意义。因此接下来我们选择与磷酸化修饰分子量相匹配的TPI@58S@+79.967进行下一步研究,该部分内容将对58S@+79.967是否为TPI发生了磷酸化修饰及其丰度在肿瘤中的升高作进一步实验验证,同时探究TPI Ser58磷酸化修饰对糖酵解代谢和肺癌发展的调控。[方法]1.A549细胞中过表达外源TPI,通过免疫共沉淀实验分别富集外源或内源TPI蛋白,SDS-PAGE电泳分离蛋白,考马斯亮蓝染色,切割目的蛋白TPI条带,质谱分析,确认Ser58是否为TPI发生+79.967 Da质量偏移的关键位点。2.制备针对TPI Ser58磷酸化修饰的特异性抗体（TPIpS58）,通过Dot blot实验初步检测三个批次TPIpS58抗体的有效性和特异性;另外构建野生型TPI及其Ser58突变体表达质粒,转染HEK293T细胞,TPI pS58抗体检测其磷酸化水平,以证实TPI pS58抗体的制备成功与否及其特异性,同时进一步证实TPI Ser58位点磷酸化修饰的存在。3.利用制备的TPIpS58特异性抗体,通过Western blot实验分别检测肺癌、胃癌、乳腺癌和胰腺癌细胞及其对应正常上皮细胞系中TPI Ser58磷酸化水平;利用肺癌、胃癌、乳腺癌和胰腺癌组织芯片,IHC实验检测其中TPI Ser58磷酸化水平,同时结合临床病理资料,分析TPI Ser58磷酸化水平与肺癌病人预后关系。4.利用TPI酶活性检测试剂盒,检测多种肺癌细胞系及正常上皮细胞系中TPI酶活性,分析肺癌细胞中TPI酶活性变化。5.构建TPI沉默（pLKO.1-shTPI）质粒,包装病毒,分别感染H157和A549细胞,Western blot实验检测TPI敲低效率;通过试剂盒分别检测其中乳酸产量及ATP水平的变化,Seahorse X96系统分析细胞外酸化率（ECAR）的变化。6.在TPI沉默的A549细胞系中,分别转染野生型TPI（TPI-WT）或其S58A突变体质粒,构建回补细胞系（shTPI/TPIWT和shTPI/TPIS58A）。Western blot和免疫荧光实验分别检测其中TPI及其Ser58磷酸化水平;利用以上回补细胞系,进一步检测其中TPI酶活性、乳酸产量、ATP水平及细胞外酸化率,明确TPI Ser58磷酸化对肺癌细胞糖酵解代谢的影响。7.利用含有13C同位素标记的葡萄糖的培养基分别培养shTPI/TPIWT和shTPI/TPIS58A细胞,收集细胞,提取代谢物,利用质谱技术对代谢物进行鉴定分析,检测TPI Ser58磷酸化水平对肺癌细胞糖酵解代谢流的影响。8.在H1299和A549细胞中分别稳定过表达plVX、TPI-WT及其突变体S58A、S58D质粒,Western blot实验检测其中TPI及其Ser58磷酸化水平;利用以上构建的过表达细胞系,进一步检测TPI Ser58磷酸化对乳酸产量、ATP水平及细胞外酸化率的影响。9.利用上述构建的TPI沉默细胞系,通过MTT、克隆形成实验检测细胞增殖能力,划痕、Transwell实验检测细胞迁移能力;上述构建的TPI沉默的A549细胞系及对照细胞系注射到裸鼠皮下,测量瘤体生长速度,4-5周取出瘤体,拍照、测量体重;同时,细胞系通过尾静脉注射到裸鼠体内,5-7周取出裸鼠肝组织,统计转移灶数量。10.利用上述构建的shTPI/TPIWT和shTPI/TPIS58A细胞系,通过MTT、克隆形成和Transwell实验分别检测TPI Ser58磷酸化对肺癌细胞增殖、迁移能力的影响;通过裸鼠皮下及尾静脉注射细胞系检测TPI Ser58磷酸化对肺癌细胞体内成瘤及转移能力的影响。[结果]1.组学数据分析发现糖酵解代谢酶中TPI@58S@+79.967的丰度在肺癌中升高最显著,通过制备的TPI pS58特异性抗体证实58S@+79.967为磷酸化修饰,且通过质谱鉴定分析发现Ser58是TPI主要的磷酸化位点。2.TPIpS58水平在肺癌细胞和组织中明显升高,同时TPIpS58高水平与肺癌病人预后呈负相关;另外TPI pS58水平在其它肿瘤,如乳腺癌、胃癌及胰腺癌中也普遍升高。3.与肺正常上皮细胞系相比,TPI酶活性在肺癌细胞中显著升高,且TPI沉默的肺癌细胞系中乳酸产量、ATP水平及细胞外酸化率均降低。4.与回补野生型TPI的shTPI/TPIWT细胞系相比,Ser58磷酸化缺失的shTPI/TPIS58A细胞系中TPI酶活性减弱,且乳酸产量,ATP水平及细胞外酸化率均降低;另外13C同位素标记的糖酵解代谢流检测分析发现在Ser58磷酸化缺失的shTPI/TPIS58A细胞系中位于TPI酶上游的代谢中间产物13C-G6P、13C-FBP、13C-DHAP积累,而其下游代谢中间产物 13C-BPG、13C-PEP、13C-Pvruvate 含量下降。5.与过表达野生型TPI的肺癌细胞系相比,过表达磷酸化缺失突变体S58A的细胞系中乳酸产量、ATP水平及细胞外酸化率均降低,另外过表达模拟磷酸化突变体S58D的细胞系中乳酸产量、ATP水平及细胞外酸化率均升高。6.与对照细胞相比,TPI沉默抑制肺癌细胞的增殖及迁移;体内实验结果显示TPI敲低可抑制肿瘤细胞的生长及转移。7.TPI Ser58磷酸化缺失抑制肺癌细胞的增殖和迁移;体内实验证实Ser58磷酸化修饰缺失抑制肿瘤细胞的生长和转移。[小结]1.Ser58是TPI蛋白的主要磷酸化位点且TPI Ser58磷酸化水平在多肿瘤中显著升高。2.TPI酶对于维持有氧糖酵解代谢和肺癌发展有重要作用。3.TPI Ser58磷酸化修饰可通过调控TPI酶活性进而促进肺癌细胞糖酵解代谢。4.TPI Ser58磷酸化修饰促进肺癌细胞的生长和转移。第四部分PRKACA激酶直接磷酸化TPI Ser58[目的]第三部分研究发现TPI Ser58磷酸化水平在肿瘤中显著升高并且调控糖酵解代谢及肺癌发展,因此本部分我们继续探究负责TPI Ser58位点磷酸化的上游激酶,进一步明确肺癌细胞内TPI Ser58磷酸化的分子调控机制。[方法]1.首先通过Netphosk数据库预测可能磷酸化TPI Ser58的激酶。提交TPI蛋白氨基酸序列到Netphosk网站,根据预测结果及文献报道,筛选可能负责肿瘤细胞内TPI Ser58磷酸化的激酶。2.对预测的可能激酶,分别利用对应抑制剂处理肺癌细胞,检测TPI蛋白及其Ser58磷酸化水平的变化,结果显示PKA激酶抑制剂可显著降低TPI Ser58磷酸化水平;进一步利用PKA激酶抑制剂处理胃癌、乳腺癌及胰腺癌细胞,Western blot实验检测TPI蛋白及其Ser58磷酸化水平的变化。3.PKA激酶抑制剂H89处理肺癌H1299和A549细胞,利用TPI酶活性试剂盒检测其中TPI酶活性的变化。4.PKA激酶激活剂8-Br-cAMP和dc-AMP分别处理肺癌、胃癌、乳腺癌及胰腺癌细胞,Western blot实验检测TPI蛋白及其Ser58磷酸化水平的变化。5.在HEK293T细胞中转染TPI表达质粒,48 h之后分别用PKA抑制剂或激活剂处理细胞,免疫共沉淀富集外源TPI,Western blot实验检测外源TPI蛋白及其Ser58磷酸化水平的变化。6.通过qRT-PCR实验检测PKA激酶三种亚型PRKACA、PRKACB、PRKACG在肺癌细胞中的mRNA水平,其中PRKACG基因的表达水平极低。7.分别利用PRKACA、PRKACB基因对应小干扰siRNA处理A549和H1299细胞,检测TPI蛋白及其Ser58磷酸化水平的变化,筛选出负责TPI Ser58磷酸化修饰的PKA激酶亚型。8.构建PKA体外激酶反应体系,首先低温诱导并纯化野生型TPI及其突变体S58A蛋白,然后分别与激酶反应缓冲液、ATP及以上筛选出的PKA激酶亚型孵育,30℃反应1 h,Western blot实验检测TPI Ser58磷酸化水平。9.利用以上筛选出的PKA激酶亚型的小干扰RNA分别处理H1299和A549细胞系,检测其中TPI酶活性及细胞外酸化率的变化。10.构建PKA激酶亚型过表达、沉默肺癌细胞系,通过克隆形成实验或Transwell实验分别检测其对肺癌细胞增殖或迁移能力的影响。[结果]1.通过Netphosk数据库预测分析发现,PKA、RSK、PKC、CDK为负责TPI Ser58磷酸化的可能激酶,另外文献已报道AKT激酶可调控糖酵解代谢,因此将以上五种激酶作为我们接下来的筛选对象。2.PKA激酶抑制剂处理肺癌细胞可导致其TPI Ser58磷酸化水平显著降低,而RSK、AKT、PKC及CDK激酶的抑制剂处理不能降低TPI Ser58磷酸化水平,同时PKA激酶抑制剂处理也可降低胃癌、乳腺癌及胰腺癌细胞内TPI Ser58磷酸化水平。3.PKA激酶抑制剂H89处理H1299和A549细胞后,TPI酶活性降低。4.PKA激酶激活剂8-Br-cAMP和dc-AMP分别处理H1299和A549细胞后,TPI Ser58磷酸化水平显著升高。5.PKA激酶抑制剂或其激活剂处理细胞也可诱导外源TPI Ser58磷酸化水平显著降低或升高。6.qRT-PCR实验结果显示PRKACG基因在肺癌细胞内的mRNA水平极低,且抑制PRKACA后TPI Ser58磷酸化水平显著降低,而抑制PRKACB激酶后TPI Ser58磷酸化水平无显著变化;体外激酶实验发现PRKACA激酶亚型可直接磷酸化TPI 58位丝氨酸。7.针对PRKACA激酶的小干扰RNA处理肺癌细胞后发现TPI酶活性和细胞外酸化率均降低。8.PRKACA基因过表达促进肺癌细胞增殖和迁移。沉默PRKACA表达抑制肺癌细胞生长和迁移。[小结]1.PKA激酶是负责肿瘤细胞内TPI Ser58磷酸化的主要激酶。2.PRKACA亚型可直接磷酸化细胞内TPI 58位丝氨酸。3.PRKACA激酶可调控肺癌细胞糖酵解代谢和生长、迁移能力。综上所述,在这项研究中,我们通过LC-MS/MS技术对NSCLC患者肿瘤及其邻近癌旁组织蛋白组中所存在的delta masses（蛋白各位点实际氨基酸残基和编码氨基酸理论分子量之间的差值）进行系统分析,即代表蛋白上存在的各种潜在修饰。生物信息学分析揭示了肺癌中糖酵解代谢酶在蛋白修饰水平上的失调,尤其是发生在TPI 58位丝氨酸的+79.967 Da分子量偏移（TPI@58S@+79.967）。通过实验证实+79.967 Da为磷酸化修饰且TPI Ser58磷酸化水平在肿瘤中普遍升高,与病人预后呈负相关,TPI Ser58磷酸化水平的减弱可抑制肺癌细胞糖酵解代谢及肺癌生长和转移。另外,我们证实了PRKACA激酶可直接磷酸化TPI Ser58位点,并进一步调控糖酵解和肺癌细胞的增殖和迁移能力。因此,我们的研究鉴定分析了存在于肺癌组织糖酵解酶上的广泛修饰,并且揭示了 TPI Ser58磷酸化在糖酵解代谢和肿瘤发展中的重要调控作用。