藏红花素对Jurkat细胞抑增殖作用及机制研究

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目的探讨藏红花素(crocin)对人急性T淋巴细胞白血病细胞株(Jurkat细胞)抑增殖及作用机制。方法实验分为对照组与实验组,实验组按照crocin终浓度分为A组(0.625 mg/ml)、B组(1.25 mg/ml)、C组(2.5 mg/ml)、D组(5.0 mg/ml)和E组(10 mg/ml)5组。采用血细胞计数板及人工计数法计数各组细胞数量,并绘制细胞生长曲线;MTT法检测细胞的增殖;Annexin V/PI双染法及流式细胞术分析各组细胞24、48h凋亡;RT-PCR检测24、48h bcl-2,bax基因的表达。结果1. Jurkat细胞增殖变化:①细胞形态:对照组细胞胞体圆形似鱼卵,胞质均匀透明,折光性好,呈葡萄串样悬浮生长;而实验各组胞体皱缩,细胞内颗粒增多,折光性减弱,当crocin浓度5和10mg/ml时则呈单个悬浮生长。②细胞数目:24h时,对照组为(7.5±0.62)×105,实验各组(A-E组)分别为(7.2±0.41)×105、(6.7±0.45)×105、(5.5±0.34)×105、(4.1±0.23)×105、(3.8±0.35)×105,B、C、D、E组明显低于对照组、A组(F=108.76,p<0.01),以D、E组数目最少(p<0.05),但该两者间无统计学意义(p>0.05)。48h时,对照组为(14.0±1.72)×105,实验各组分别为(9.5±1.15)×105、(8.2±0.94)×105、(7.0±0.63)×105、(2.5±0.27)×105、(2.2±0.22)×105,明显低于对照组(F=151.97,p<0.01),以D、E组数目最少(p<0.05),但该两者间无统计学意义(p>0.05)。③增殖抑制率:24h时,对照组抑制率为(1.826±0.025)%,实验各组分别为(3.566±0.025)%、(34.174±1.042)%、(43.582±1.745)%、(70.116±1.603)%、(71.086±1.756)%,B、C、D、E组明显高于对照组、A组(F=2586.52,p<0.01),以D、E组抑制率最高(p<0.05),但该两者间无统计学意义(p>0.05)。48h时,对照组为(2.002±0.011)%,实验各组分别为(16.082±2.236)%、(53.080±2.503)%、(67.346±1.678)%、(84.932±1.337)%、(86.041±2.067)%,明显高于对照组(F=1755.66,p<0.01),以D、E组抑制率最高(p<0.05),但该两者间无统计学意义(p>0.05)。相同crocin浓度下,作用48h均明显高于24h(p均<0.01)。2.Jurkat细胞凋亡变化:24h时,对照组细胞凋亡率为(0.347±0.208)%,实验各组分别为(2.107±0.417)%、(6.830±1.080)%、(9.167±1.478)%、(21.950±1.725)%、(22.850±1.541)%,B、C、D、E组明显高于对照组、A组(F=190.69,p<0.01),以D、E组凋亡率最高(p<0.05),但该两者间无统计学意义(p>0.05)。48h时,对照组为(0.580±0.300)%,实验各组分别为(9.150±1.010)%、(12.540±1.490)%、(19.060±1.601)%、(38.980±1.712)%、(40.220±1.243)%,明显高于对照组(F=1755.66,p<0.01),以D、E组凋亡率最高(p<0.05),但该两者间无统计学意义(p>0.05)。相同crocin浓度下,作用48h均明显高于24h(p均<0.01)。3.bcl-2、bax基因表达:①bcl-2表达:24h时,对照组灰度扫描比值为(0.802±0.017),实验各组分别为(0.782±0.015)、(0.702±0.017)、(0.636±0.020)、(0.536±0.022)、(0.515±0.021),B、C、D、E组明显低于对照组、A组(F=124.78,p<0.01),以D、E组下调最明显(p<0.05),但该二者间无统计学意义(p>0.05)。48h时,对照组为(0.794±0.026),实验各组分别为(0.685±0.020)、(0.646±0.018)、(0.547±0.023)、(0.420±0.016)、(0.398±0.017),明显低于对照组(F=176.08,p<0.01),以D、E组下调最显著(p<0.05),但该二者间无统计学意义(p>0.05)。相同crocin浓度下,作用48h均明显低于24h。(p均<0.05)。②bax表达:24h时,对照组灰度扫描比值为(0.634±0.019),实验各组分别为(0.664±0.016)、(0.767±0.020)、(0.837±0.020)、(0.920±0.017)、(0.931±0.015),B、C、D、E组明显高于对照、A组(F=148.59,p<0.01),以D、E组上调最明显(p<0.05),但该二者间无统计学意义(p>0.05)。48h时,对照组为(0.649±0.023),实验各组分别为(0.792±0.022)、(0.827±0.016)、(0.926±0.014)、(1.047±0.017)、(1.071±0.019),明显高于对照组(F=221.67,p<0.01),以D、E组上调最显著(p<0.05),但该二者间无统计学意义(p>0.05)。相同crocin浓度下,作用48h均明显高于24h(p均<0.05)4.细胞凋亡与基因表达:①Bcl-2与凋亡:Pearson相关系数为-0.964,p=0.00,差别有显著性,bcl-2基因表达与凋亡呈强负线性相关。②Bax与凋亡:Pearson相关系数为0.957,p=0.00,差别有显著性,bax基因表达与凋亡呈强正线性相关。③Bcl-2与bax:Pearson相关系数为-0.983,p=0.00,差别有显著性,bcl-2与bax呈强负线性相关。结论1、当crocin浓度为0.625-10mg/m1时,体外均可抑制Jurkat细胞的增殖,并呈现出剂量时间依赖关系,浓度为5.0 mg/ml、作用48h时抑制作用最明显。2、Crocin可以诱导Jurkat细胞凋亡,在0.625-10mg/ml范围内,细胞凋亡率逐渐升高,浓度为5.0 mg/m1、作用48h时细胞凋亡最高。3、在0.625~10/ml范围内,Crocin可以抑制bcl-2基因表达,浓度为5mg/ml、作用48h时抑制作用最明显,bcl-2基因表达与凋亡呈强负线性相关。4、0.625~10/mlCrocin可以促进Bax基因的表达,浓度为5mg/ml、作用48h时促进作用最明显,bax基因表达与凋亡呈强正线性相关。5、Crocin可抑制增殖,促进细胞凋亡,其机制可能与bcl-2表达下调、bax表达上调有关。
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