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[背景]结核病是有结核分枝杆菌引起的的一种传染病,是全球关注的公共卫生和社会问题。根据2010年统计资料显示,全球每年结核(TB)新增病例880多万人,死亡145万多人。目前,仍然没有一种能够快捷、准确、方便、特异地诊断结核的方法。[目的]本研究将克隆表达纯化RD5区编码的重组蛋白,以寻找能够快速提高结核病诊断敏感性和特异度的潜在标志物。[方法]从H37Rv基因组中PCR扩增RD5区5个目的基因,使用限制性内切酶进行双酶切,和同样经双酶切处理的pET-21a, pET-32a, or pET-28b质粒连接,连接产物转入转入大肠杆菌BL21(DE3)plysS感受态细胞,质粒经测序验证正确后,并经IPTG诱导表达含His-tag的重组蛋白,利用IMAC亲和色谱柱纯化目的蛋白。利用ELISA对肺结核病活动者、接种过BCG以及接种过BCG的健康对照组进行RD5区重组蛋白和已知蛋白抗原ESAT-6的血清免疫应答水平评价。本研究结果采用单尾ANOVA检测和独立样本T检验,所用软件为SPSS17.0统计软件。[结果]本研究成功纯化出RD5区编码的高纯度的重组蛋白,利用酶联免疫吸附试验在活动肺结核和健康对照组中对其进行血清免疫活性评价,同时将这五个重组蛋白的血清学免疫活性与已知蛋白EAST-6进行比较分析。蛋白EAST-6被普遍应用于结核病免疫诊断的研究。ESAT-6, Rv3117、Rv3118、Rv3119、Rv3120和Rv3121蛋白的检测敏感度分别为21.7%,25.0%,11.7%,11.7%,31.7%和5.0%；检测特异性分别为90.6%,96.9%,90.6%,96.9%,96.9%,and87.5%。最重要的是Rv3117和Rv3120的检测敏感度和特异性明显高于已知蛋白ESAT-6。在菌阳结核病患者中,‘Rv3117和Rv3120的检测敏感性与ESAT-6的敏感性相当,而在菌阴肺结核患者中Rv3117和Rv3120的检测敏感度(25.0%,41.7%)明显高于ESAT-6(8.4%)的敏感度。我们利用酶联免疫反应OD值绘制了这六个蛋白的工作曲线(ROC)。同时计算出曲线下面积,ESAT-6, Rv3117、Rv3118、Rv3119、Rv3120和Rv3121的ROC曲线下面积分别为0.680,0.757,0.656,0.632,0.735和0.609。该结果说明Rv3117和Rv3120的检测能力高于其他几个蛋白。[结论]综上所述,本研究结果显示Rv3117和Rv3120可能作为结核血清免疫诊断的潜在标志物。这两个蛋白在所用的活动性肺结核和所有的健康对照组中的免疫反应水平的差异具有统计学显著性意义。因此本研究下一步的任务是对Rv3117和Rv3120重组蛋白的细胞免疫活性进行评价,以提高结核病诊断检测的敏感度和特异性。