研究背景：糖尿病是一种多病因代谢性疾病,其中占绝对比例的2型糖尿病(type 2 diabetes, T2D)在世界范围内迅猛增加,由T2D引发的全球健康及经济负担已到令人担忧的地步,推测2035年将突破592百万人次。在中国,随着老龄化社会的到来,T2D及并发症更为严重。最新统计表明,中国成年人群的糖尿病总体发病率达11.6%,然而T2D的致病机制尚未阐明,目前仍缺乏行之有效的早期干预措施,糖尿病及由此而引发的心脑血管病、慢性肾病势必成为严重的公共卫生问题。因此,深入研究T2D的发生机制,明确其关键致病基因、寻找新型靶点对于T2D的早期诊断和治疗及开发新型药物均具有重要的研究意义。研究表明,巨噬细胞失能及炎性体活化是T2D致病及并发症发生的重要环节。在T2D发生过程中,高糖、高脂微环境可导致脂肪细胞肥大、缺氧和坏死,刺激脂肪组织及血管间质细胞释放促炎因子TNF-α、MCP-1等,引起外周巨噬细胞向脂肪组织浸润。活化的巨噬细胞分泌大量炎性因子,进一步促进巨噬细胞向肝脏、胰腺及脂肪组织募集,从而形成巨噬细胞浸润的恶性循环,导致胰岛素抵抗和T2D的发展。糖尿病病人或动物模型单核细胞源的巨噬细胞分泌IL-1β上调,并伴有NLRP3炎性体的活化。在T2D中,IL-1β通过对抗胰岛素信号促进胰岛素抵抗,抑制葡萄糖摄取和降低糖耐量,同时,慢性低度炎症状态及高糖高脂环境可诱导IL-1β依赖的胰岛β细胞凋亡,有学者提出IL-1β是T2D发病的重要驱动因素。在T2D的发生发展过程中,由代谢堆积产生的“危险因子”激活NLRP3炎性体,后者直接引起IL-1β的成熟和释放增加,活化后的IL-1β一方面直接引起胰岛β细胞的死亡和损伤,另一方面通过全身炎症反应和导致巨噬细胞浸润进一步加重胰岛β细胞功能障碍,最终导致T2D的发生。因此,调节巨噬细胞及炎性体活化的免疫分子可能在T2D的发生发展过程中扮演重要角色。免疫调节分子T细胞免疫球蛋白与黏蛋白域蛋白-4(T cell immunoglobulin-and mucin-domain-containing molecule, TIM-4)是一个新型的免疫调节分子,其选择性表达于抗原提呈细胞,尤其高表达于巨噬细胞和成熟的树突状细胞,在免疫耐受的维持中发挥重要作用。研究表明,TIM-4作为磷脂酰丝氨酸的受体,通过促进吞噬细胞对凋亡细胞的吞噬维持机体内环境的稳定,利用抗体阻断TIM-4或基因敲除可诱导自身抗体的产生并出现自身免疫病样症状,提示TIM-4在自身免疫性疾病发生中发挥保护作用。实验室前期研究发现,TIM-4过表达可下调巨噬细胞系RAW264.7细胞中CD80、CD86、MHCⅡ分子的表达、TNF-α的产生,而阻断TIM-4则可以促进LPS诱导的巨噬细胞活化,表明TIM-4可以负调控巨噬细胞的活性,尾静脉转输过表达Tim-4的巨噬细胞可保护ConA诱导的免疫性肝损伤。另外,发现系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)患者外周血单个核细胞中TIM-4 mRNA的表达水平显著高于正常对照,且SLE患者TIM-4表达水平与血浆TNF-α正相关,提示SLE患者TIM-4表达升高可能是机体的负反馈性保护机制。另有文献报道,TIM-4与类风湿性关节炎、强制性脊柱炎、过敏性哮喘等多种免疫性疾病的发生密切相关,然而TIM-4在T2D发生中的作用目前尚未见相关文献报道。本文利用临床病例初步探讨了TIM-4与T2D发生的相关性,并进一步研究了其对对NLRP3炎性体的调节作用。研究目的明确TIM-4与T2D发生的相关性,并初步探讨其作用机制,为T2D的诊断、治疗提供新的思路；阐明TIM-4对NLRP3炎性体的调节效应,鉴定其新型生物学功能,为NLRP3炎性体相关疾病的干预提供新的靶点；构建人TIM-4启动子报告基因载体并检测其活性,为TIM-4的表达调控研究奠定基础。方法与结果1.T2D患者外周血单个核细胞中TIM-4 mRNA的表达显著升高根据T2D的诊断标准,收集51例T2D患者及39例健康对照抗凝外周静脉血,Ficoll分离外周血单个核细胞,TRIZOL提取总RNA,利用试剂盒逆转录成cDNA,荧光实时定量PCR检测TIM-4 mRNA的表达,统计学分析T2D患者与健康对照之间的差异。结果发现,T2D患者TIM-4mRNA的表达水平显著高于健康对照组,表明TIM-4在T2D进程中可能发挥潜在的作用。2.T2D患者外周血单个核细胞TIM-4 mRNA水平与hsCRP和IL-1β相关在前期研究中,我们发现在SLE病人中TIM-4 mRNA的表达水平与炎症因子TNF-α呈正相关,表明前炎性因子可能诱导TIM-4的表达。在本研究中,收集T2D患者血清,ELISA检测IL-1β、IL-18及hsCRP的水平,进一步分析TIM-4 mRNA水平与上述炎症因子的相关性。与前期结果一致,T2D患者外周血单个核细胞的TIM-4 mRNA水平与hsCRP呈正相关,进一步表明TIM-4表达的增加可能是被增高的炎性因子诱导所致。然而发现,外周血单个核细胞TIM-4 mRNA水平和血清IL-1β呈负相关,与IL-18也呈负相关趋势,并且IL-1β与IL-18显著正相关,提示TIM-4可能抑制IL-1β及IL-18的产生。3.T2D患者中血清IL-1β水平与HbAlc呈正相关为明确T2D患者中IL-1β升高的重要作用,我们进一步分析了IL-1β与HbAlc、LDL、HDL以及其它临床指标的相关性。结果显示,T2D患者IL-1β水平与HbAlc呈正相关,但未发现IL-1β与其它指标的相关性,表明高水平的IL-1β可能加重T2D进程。4.T2D病人中TIM-4 mRNA与HbAlc和LDL呈负相关我们进一步分析了TIM-4 mRNA与代谢指标的相关性。结果发现,TIM-4 mRNA与LDL呈负相关,并与HbAlc有负相关趋势,但未发现TIM-4与禁食血糖、总胆固醇、HDL胆固醇、甘油三酯的相关性,这些结果表明TIM-4在T2D的进程中可能发挥保护作用。5.载体构建以pcDNA3.0为骨架载体,以pcDNA3.0-mTIM-4为模板,构建携带HA标签的小鼠Tim-4全基因表达载体pcDNA3-mTim-4-HA,以pcDNA3-hTIM-4-HA为模板,利用定点突变试剂盒构建mucin结构域缺失的突变载体pcDNA3-hTIM-4(△ mucin)-HA,以酶切、测序鉴定载体的正确性,Western blot检测其表达。经blast分析,所构建载体测序结果与目的基因序列完全一致,Western blot可检测到标签蛋白HA的表达。6. NLRP3炎性体活化细胞模型的建立将THP-1细胞培养于24孔细胞培养板中,利用终浓度为1 μg/ml的LPS刺激4 h,再以5mM ATP刺激30 min后,离心,取细胞培养上清,ELISA检测IL-1β的水平。结果表明,经LPS. ATP刺激后,上清中IL-1β的水平明显升高,表明成功建立了NLRP3炎性体的活化细胞模型。将HEK293细胞接种于24孔培养板中,取pDsRed-monomer-C1-human ASC 5 ng、pDsRed-monomer-C1-human caspase-15 ng、pcDNA3-hNLRP3 15 ng、 pDsRed-monomer-C1-human IL-1β 150 ng、混匀,利用Lipofectin2000共转染HEK293细胞,旨在建立NLRP3炎性体重构模型。转染48 h后,收取细胞及其上清,ELISA检测上清中IL-1β,RT-PCR检测各组分mRNA的表达。结果显示,RT-PCR可检测到NLRP3炎性体各组分mRNA的表达,ELISA结果显示共转染组产生较高水平的IL-1β,提示成功建立NLRP3炎性体的重构体系。7.利用腹膜炎模型证实TIM-4在体内对NLRP3炎性体的抑制效应利用6-8周龄、雄性C57BL/6腹腔注射LPS (20mg/kg),2h后再腹腔注射AL(OH)3 800μg,4 h后收集腹腔液,ELISA检测IL-1β的水平,结果显示LPS/AL(OH)3注射组腹腔液中可检测到较高水平的IL-1β,表明腹膜炎模型构建成功。将60μgpcDNA3-mTim-4-HA或空载体pcDNA3质粒DNA与转染试剂PEI按氮磷比10：1混合制备200 μ l的混合物,室温孵育15 min。将C57BL/6小鼠随机分为两组,每组3只,一组尾静脉注射pcDNA3-mTim-4-HA质粒,另一组尾静脉注射空载体pcDNA3质粒,质粒注射24 h后,两组小鼠均腹腔注射20 mg/kg LPS及800μg AL(OH)3, ELISA检测腹腔液IL-1β的水平,RT-PCR检测Tim-4 mRNA的表达。结果显示Tim-4质粒注射组IL-1 β的水平显著低于空载体对照组,Tim-4质粒注射组腹腔细胞中Tim-4 mRNA的表达水平显著高于对照组。将Tim-4 siRNA慢病毒或对照病毒(4×107U/0.1ml/只)经尾静脉注射入C57BL/6小鼠体内,7d后,同上构建腹膜炎模型并检测IL-1β及Tim-4 mRNA及其蛋白的表达。结果显示Tim-4 siRNA组腹腔液中IL-1β的水平显著高于对照组,并且Tim-4 siRNA注射组脾及肝单个核细胞中Tim-4 mRNA的表达水平显著低于对照组,流式细胞术也检测到脾细胞及肝单个核细胞中Tim-4表达降低。8.TIM-4对巨噬细胞NLRP3炎性体表达的影响利用polyplus将TIM-4 siRNA及对照NC siRNA分别转染THP-1细胞,转染48 h后,分别利用RT-PCR检测TIM-4、NLRP3、ASC、caspase-1及IL-1β mRNA的表达。结果显示,TIM-4 siRNA转染组TIM-4表达水平降低,而且TIM-4 siRNA组ASC的表达水平升高。小鼠腹腔注射6%淀粉溶液,72 h后常规分离小鼠腹腔巨噬细胞,转染小鼠Tim-4 siRNA或对照,转染48 h后,检测Tim-4、NLRP3炎性体各组分的表达。结果显示,Tim-4 siRNA转染组Tim-4 mRNA的表达水平降低,而且Tim-4 siRNA组IL-1β mRNA的表达水平升高。9.TIM-4启动子的构建及活性检测以外周血基因组DNA为模板,PCR扩增、构建人TIM-4启动子pGL3-hTIM-4(-1241～+49),并酶切、测序鉴定。用HEK293细胞以1.5×105个/m1的密度铺于48孔培养板中,启动子质粒DNA 500 ng/孔、pGL-TK 10 ng/孔用脂质体Lipo2000法转染细胞,转染48 h后,利用荧光计数仪检测系统检测启动子与内参pGL-TK Renilla的荧光素酶活性,取得并比较其ratio值。测序结果经Blast比对分析,pGL3-hTIM-4 (-1241～+49)构建成功,荧光素酶报告基因检测显示,构建的启动子具有良好活性。结论1.T2D患者外周血单个核细胞中TIM-4 mRNA的表达水平显著高于正常人,T2D患者TIM-4 mRNA水平与外周血hsCRP呈正相关,但与IL-1β、LDL呈负相关,并与IL-18、HbAlc呈负相关趋势,而T2D患者IL-1β与HbAlc呈正相关,提示TIM-4可能通过影响IL-1β产生参与T2D进程。2.TIM-4可抑制NLRP3炎性体的活化,但TIM-4发挥抑制效应的关键结构域及分子机制尚不清楚,另外发现,TIM-4可抑制ASC、IL-1β mRNA的表达,其具体机制有待于进一步研究。3.获得具有良好活性的人TIM-4启动子。创新点及意义本研究通过体内实验证明TIM-4可抑制NLRP3炎性体的活化,另外发现T2D患者外周血单个核细胞TIM-4 mRNA水平显著升高并与IL-1β、LDL水平显著负相关,并与HbAlc、IL-18呈负相关趋势,推测TIM-4可能通过抑制NLRP3炎性体的活化参与T2D进程。该研究阐明了TIM-4新型生物学功能,发现TIM-4表达水平与T2D发生有关,本文研究结果为T2D的发病机制研究提供了新的思路,并为其诊断、治疗提供新的候选靶点。