羟基磷灰石纳米粒子抑制肝癌细胞增殖及其机理研究

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纳米粒子由于其独特的纳米生物学效应,已成为目前肿瘤防治研究工作的热点。羟基磷灰石纳米粒子具有抗癌活性,又具有良好的生物相容性,因而在抗肝癌研究中,受到越来越多的关注。本文选用均匀沉淀法成功制备出粒径范围主要为44.6nm~86.8nm(HAP1)、301.6nm~1339.3nm(HAP2)、843.2nm~2443.0nm(HAP3)三种羟基磷灰石粒子。用0.14mmol/L、0.28mmol/L、0.56mmol/L的HAP1纳米粒子以及0.56mmol/L浓度的HAP2和HAP3粒子与肝癌细胞作用,通过光镜观察和MTT法、生长曲线及集落形成率定量测定,结果显示HAP1纳米粒子对肝癌细胞的增殖能力有剂量和时间依赖性抑制作用,以0.56 mmol/L浓度处理肝癌细胞4d可达到显著的抑制作用;而0.56 mmol/L浓度的HAP2和HAP3粒子对肝癌细胞的作用都很弱。由此推断HAP1纳米粒子的抑制肝癌细胞增殖作用与粒径、浓度及作用时间有关,这为其体内外抗癌研究提供了依据。通过三种不同粒径的HAP粒子与肝癌细胞相互作用,经形态学观察与分析可知HAP1纳米粒子很容易与肝癌细胞膜结合,肝癌细胞以非网格蛋白介导的细胞膜穴样内陷途径胞吞HAP1纳米粒子进入肝癌细胞,而HAP2和HAP3粒子不易与肝癌细胞膜结合,因而很少进入肝癌细胞。通过Fluo-3荧光探针标记细胞内游离Ca2+,经荧光显微镜观察,HAP1纳米粒子使肝癌细胞的荧光增强,这说明HAP1纳米粒子进入肝癌细胞后,胞浆成份促进其降解。通过Feulgen染色、AgNOR染色以及免疫细胞化学PCNA染色,光镜观察以及图像分析软件的定量测定,HAP1纳米粒子使肝癌细胞的平均细胞核DNA含量下降、核仁内AgNOR数量减少以及PCNA表达减弱,从分子生物学角度证实了HAP1纳米粒子体外抑制肝癌细胞的作用,同时也揭示了HAP1纳米粒子的抑癌机理①通过抑制DNA合成,主要是通过抑制DNA合成过程中所需的DNA聚合酶PCNA的活性,干扰DNA的合成;②通过抑制rDNA的转录活性,抑制rRNA的合成,进一步抑制细胞内蛋白质的合成;③通过抑制PCNA的活性,影响细胞增殖周期的顺利进行,延长细胞增殖时间。流式细胞术检测结果也证实肝癌细胞被阻滞于增殖周期的G1期。通过形态学观察以及定量测试方法,可知HAP1纳米粒子体外抗肝癌作用缓慢,并不能快速杀死肝癌细胞,而首先是作为一种抑制肝癌细胞增殖作用的药物,通过逐渐影响其功能,最终导致细胞死亡。推测HAP1纳米粒子是通过其降解产物以及粒子本身共同影响细胞的功能,表现出肝癌细胞由局部到整体的超微结构变化,最终诱导肝癌细胞以非程序性死亡的方式死亡—胀亡。成功建立了符合肝癌形态学特征的人肝癌裸鼠移植瘤模型,采用瘤内局部注射途径,HAP1纳米粒子能明显抑制肝癌移植瘤生长,治疗1周和2周的抑瘤率分别为77.21%和51.32%。能明显延长荷瘤鼠的生存时间。对肝癌移植瘤组织做石蜡切片,Feulgen染色、AgNOR染色以及免疫组织化学PCNA染色,通过光镜观察和图像分析软件定量测定,HAP1纳米粒子使移植瘤组织肝癌细胞的平均核DNA含量下降、核仁内AgNOR数量减少以及PCNA表达减弱,从分子生物学角度证实HAP1纳米粒子能明显抑制移植瘤的肝癌细胞增殖,同时也揭示了抑制机理。通过电镜观察发现移植瘤组织的肝癌细胞内有HAP1纳米粒子,推测其与进入体外培养肝癌细胞的方式相同,并在胞质内降解,可能同样是以降解产物及粒子本身影响细胞的功能,最终导致移植瘤组织的肝癌细胞死亡。由于体内是实体瘤组织,HAP1纳米粒子在肝癌组织的浓度高低分布不同,诱导肝癌细胞以程序性以及非程序性两种方式死亡—凋亡及胞体割裂。总之,HAP1纳米粒子体内抗肝癌的机理是:首先,①抑制肝癌细胞增殖,通过抑制DNA合成,主要是抑制DNA合成过程中所需的DNA聚合酶PCNA的活性,干扰DNA的合成。通过抑制rDNA的转录活性,抑制rRNA的合成,进一步抑制蛋白质的合成。通过抑制PCNA的活性,阻滞细胞增殖周期。最终起到明显抑制肝癌细胞增殖的作用;②可能也具有诱导肝癌细胞分化的作用;③肝癌细胞被诱导以凋亡和胞体割裂两种方式死亡。
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