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肠杆菌科细菌是社区和医院细菌感染最重要病原菌,约占所有革兰氏阴性杆菌感染的80%,可导致患者尿路、肠道、胆道和腹腔感染以及败血症等。碳青霉烯类抗菌药物是针对革兰氏阴性菌的广谱β-内酰胺类抗菌药物,被认为是自20世纪80年代以来抗革兰氏阴性菌的最后一道防线。但随着该类药物在临床上的广泛使用,肠杆菌科细菌（carbapenem-resistant Enterobacteriaceae,CRE）对碳青霉烯类药物的耐药率逐年增高,目前CRE在医疗机构的快速流行和播散,已成为全球公共卫生的重大问题。2013年在美国疾病控制与预防中心发布的“细菌耐药威胁报告”中将CRE列为“紧急威胁”的首位。CRE所致感染后果严重,死亡率高,却缺乏有效的治疗药物。用于CRE治疗药物主要包括多黏菌素、替加环素、磷霉素及氨基糖苷类,临床上多采用两药甚至三药联合治疗,但多药联合在增强杀菌效果的同时,也显著增加患者不良反应机率。因此,针对碳青霉烯类药物耐药机制,精准地采取有效措施阻断或延缓CRE的传播与蔓延具有重大的临床意义。肠杆菌科细菌对碳青霉烯类药物耐药机制主要有三种:（1）产生碳青霉烯酶;（2）青霉素结合蛋白靶位结构改变;（3）产生AmpC和/或超广谱β内酰胺酶（ESBL）合并膜孔蛋白突变。产生碳青霉烯酶是肠杆菌科细菌对碳青霉烯类耐药最主要原因,常见的碳青霉烯酶包括KPC、NDM、IMP、OXA等。碳青霉烯酶耐药基因可由染色体或质粒携带,其中质粒是碳青霉烯酶基因传播的主要载体,质粒可通过接合、转化、转导等方式使耐药基因在不同菌株、不同菌种、不同菌属之间传播,造成产碳青霉烯酶耐药菌的快速播散。虽有大量研究报道耐药质粒的播散,但因其影响因素众多,机制复杂,其具体机制尚不明确,仍有待研究。据此本研究收集全国四个省份临床分离的碳青霉烯类药物低敏感肠杆菌科细菌,筛选出产碳青霉烯酶CRE,分析碳青霉烯酶耐药基因环境和质粒的精细结构,并对影响碳青霉烯酶耐药基因的质粒水平传播的影响因素进行探索,以期为阐明碳青霉烯酶耐药基因的传播机制提供理论依据。本研究包括三部分:第一部分:临床分离耐碳青霉烯肠杆菌科细菌的筛选本部分收集全国四个省市172株碳青霉烯类药物低敏感（亚胺培南MIC≥1μg/mL）肠杆菌科细菌,通过药敏试验、改良Carba NP法检测碳青霉烯酶、PCR扩增耐药基因筛选产碳青霉烯酶CRE,并对耐碳青霉烯的肺炎克雷伯菌进行MLST分型分析。172株肠杆菌科细菌包括大肠埃希菌9株,肺炎克雷伯菌98株,弗氏柠檬酸杆菌7株,阴沟肠杆菌57株,非脱羧勒克菌1株。药敏结果显示,172株低敏感肠杆菌科细菌中有69株对亚胺培南和美罗培南耐药,即69株CRE。69株CRE较碳青霉烯敏感的菌株具有更高的耐药率和更大的MIC,对β-内酰胺类抗菌药物（氨苄西林、头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南）耐药率均在70%以上,对阿米卡星耐药率最低,为34.78%。对69株CRE采用改良Carba NP法检测碳青霉烯酶,结果显示共44株CRE产碳青霉烯酶,其中33株产A酶,9株产B酶,2株同时产A酶和B酶。其它25株CRE的耐药机制可能为非碳青霉烯酶机制。对44株产碳青霉烯酶CRE,采用PCR法进行碳青霉烯酶基因扩增,其中仅40株细菌碳青霉烯酶基因扩增为阳性,提示其他4株可能存在新的耐药基因型或者部分耐药基因发生了突变。这40株CRE中包括blaKPC阳性32株,blaNDM阳性7株,blaIMP阳性4株。值得注意的是,有两株产2种以上碳青霉烯酶的菌种,其中15K323菌株（肺炎克雷伯菌）blaKPC和blaNDM两种碳青霉烯酶基因均为阳性,P10159（弗氏柠檬酸杆菌）则blaKPC、blaNDM和blaIMP三种碳青霉烯酶基因均为阳性。对26株产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌进行MLST分型分析,结果有6个基因型,其中,最常见的基因型为ST11型（14株）,其它还包括ST133型（5株）、ST37型（3株）、ST686型（2株）、ST107型（1株）、ST215型（1株）。第二部分:碳青霉烯酶耐药基因传播的遗传基础研究前一部分我们对产碳青霉烯酶菌株进行筛选和分布研究,并对其遗传背景进行初步分析。本部分我们选择含有多种碳青霉烯酶及高耐药的菌株进行耐药机制研究,首先进行质粒的分离、鉴定和测序,如分离质粒与细菌耐药表型和耐药基因的情况不符,推测存在多个质粒的可能,则提取细菌所含细菌基因组和质粒测序,并拼接注释全部质粒序列。通过测序了解耐药基因环境和质粒的精细结构,为下一步研究碳青霉烯酶耐药基因在质粒中的传播机制奠定基础。测序的7株肠杆菌中,均存在碳青霉烯酶耐药基因质粒,经序列分析比对发现碳青霉烯酶耐药基因位于插入序列和/或转座序列中,除pP10164-3外,其它质粒与已报道的质粒骨架结构相似度均在90%以上,核苷酸序列相似度约为99%,多表现为耐药可变区的变化。这些质粒虽已有报道,但在弗氏柠檬酸杆菌和非脱羧勒克菌中尚属首次。弗氏柠檬酸杆菌P10159菌株高通量测序结果显示共有5个耐药质粒,分别为pP10159-1,pP10159-2,pP10159-3,pP10159-4和pP10159-5。其中pP10159-1携带blaNDM-1,与IncX3型质粒pNDM-HN380高度相似;pP10159-2携带blaIMP-4和qnrS1,与IncN1型质粒pP378-IMP高度相似;pP10159-3携带blaKPC-2,与pHS062105-3和pECN49-KPC基因结构非常相似,它们属于未知不相容组中的一种新型质粒;多耐药质粒pP10159-4和pP10159-5骨架区分别与IncHI4型质粒pNDM-CIT和Ⅱ型IncA/C2质粒pR55高度相似,但外源插入耐药区与pNDM-CIT和pR55不同。P10159的5个耐药质粒共包括24个不同的基因或基因位点,其对13种抗菌药物或毒性化合物耐药。非脱羧勒克菌P10164菌株高通量测序结果显示共有3个耐药质粒,分别为pP10164-NDM,pP10164-2和pP10164-3。其中pP10164-NDM与IncF IIY型质粒pKOXNDM1高度相似,blaNDM-1基因位于复合转座子Tn125中;pP10164-2与粘质沙雷氏菌IncHI2型质粒R478相似,而pP10164-3与任何已知的DNA序列均没有序列相似性,质粒pP10164-2和pP10164-3两者均携带大量耐药基因对至少10类抗菌药物和7类重金属耐药。其它5株肠杆菌均只发现一个耐药质粒,质粒DNA高通量测序结果显示,大肠埃希菌14E509质粒p14E509-NDM携带blaNDM-1,与IncX3型质粒pNDM-HN380高度相似;肺炎克雷伯菌HB27、ZJ121、15K169和15K366中各携带一个含有blaKPC的质粒,分别为pHB27-KPC、pZJ121-KPC、p15K169-KPC和p15K366-KPC,四个质粒之间基因结构很相似,且与已知的肺炎克雷伯氏菌IncFII型的质粒p0716-KPC和p12181-KPC具有较高的同源性,它们的耐药基因插入区包括MDR区域、blaKPC区和Tn6029。本研究筛选的高耐药菌株P10159同时产NDM、IMP和KPC三种碳青霉烯酶,有5种不同的耐药质粒,分别携带不同的耐药基因,提示多质粒共存是细菌高耐药和泛耐药的重要条件,而此类多种碳青霉烯酶共存,多质粒共存的高耐药菌株非常罕见,具有深入研究的价值。另外本部分研究建立了“小片段库二代高通量测序+大片段库二代高通量测序”和“小片段库二代高通量测序+三代高通量测序”策略进行基因组测序,完成染色体和质粒序列的准确组装,为以后开展多质粒共存导致高耐药的研究奠定了技术基础。下一部分我们将在此基础上,重点探讨影响携碳青霉烯酶耐药基因质粒传播的关键环节。第三部分:质粒携带碳青霉烯酶耐药基因水平转移机制研究本部分以高耐药的产碳青霉烯酶的菌株为研究对象,通过自然传代使质粒丢失,并通过转化结合等方式使不携带质粒的菌株获得质粒,借助RNA-seq分析质粒丢失前后与质粒获得前后的细菌转录组表达差异,采用RT-PCR验证,通过生物信息学分析其关键基因,并以基因敲除等方法进行验证。4株高耐药的产碳青霉烯酶的菌株进行质粒传代丢失试验,其中14E509(含blaNDM质粒)在传代35次后质粒丢失,获得质粒消除株14E509(blaNDM-),其它3株高耐药菌传代100次后仍未见质粒丢失。E259作为不携带质粒的菌株,通过电转方式转入p14E509获得质粒转入菌株14E509NDME259。借助RNA-seq分析质粒丢失前后与质粒获得前后的细菌转录组表达差异,结果发现,14E509 vs.14E509(blaNDM-)表达上调基因数有514个,下调基因数有767个。E259vs.14E509NDME259表达上调基因数有24个,下调基因数有22个。通过GO分析、pathway富集分析、KEGG代谢通路分析,结合显著差异表达基因分析发现,质粒丢失和获取可能与多种因素多条通路相关,影响最大的是丙酸代谢通路和群体感应系统通路,但显著差异表达的entrizid:947500（geneid:mqsR）这个基因被多次富集到生物信息学信号通路上,提示mqsR可能是质粒传播的关键环节。通过mqsR基因敲除发现mqsR基因缺失株生物膜形成能力减弱,生物膜内细菌摄取外源耐药质粒频率显著降低(3.33×10-7±9.41×10-88 vs 1.57×10-8±1.38×10-8,P<0.05),但对于浮游菌,mqsR基因敲除株质粒的摄取能力虽下降(2.37×10-9±7.85×10-1010 vs1.59×10-9±1.01×10-9,P>0.05),但却无统计学差异,提示mqsR对生物膜内质粒的传播具有重要的促进作用,但对浮游菌质粒的摄取影响不显著。综上,本部分研究发现携碳青霉烯酶基因质粒的丢失和获得可能与多种因素多条通路相关,影响最大的是丙酸代谢通路和群体感应系统通路,并首次发现mqsR对生物膜内质粒的传播具有重要的促进作用,但除mqsR以外其它的信号通路还有待进一步验证。主要结论:1.在研究的地区,KPC、NDM和IMP是临床分离肠杆菌科细菌碳青霉烯酶的主要类型,在肺炎克雷伯菌中以KPC为主;2.ST11是最常见的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的基因型,提示ST11可能更易于获得耐药基因和质粒,或其基因更适于质粒的稳定复制保留;3.耐药质粒是肠杆菌科细菌耐碳青霉烯的主要原因,质粒播散导致肠杆菌科细菌快速增加,多质粒共存是细菌高耐药和泛耐药的重要条件;4.在本研究中,质粒丢失和获得对宿主肠杆菌影响最大的是丙酸代谢通路和群体感应系统通路。5.质粒的丢失和获得可能与多种因素多条通路相关,mqsR对生物膜内质粒的传播具有重要的促进作用,但对浮游菌质粒的摄取影响不显著,其机制仍需进一步研究。