研究背景肝细胞癌是最常见的原发性肝癌病理学类型,由于其生物学特性以及肝脏自身解剖学特点,容易形成门静脉癌栓,导致预后不良。近年来虽然建立了以手术治疗为核心的综合治疗体系,但整体治疗效果仍有待提高。因此,深入研究肝细胞癌进展的相关机制,寻找更加有效的治疗靶点及疗效预测标志物,制定个体化治疗策略,仍是目前临床研究的焦点。肝细胞癌的异质性表现于不同患者之间、同一患者的不同病灶之间及同一病灶的内部,是影响治疗效果的主要原因之一。既往来自整体样本混合测序方法得到的结果是样本内所有细胞基因表达的平均值,掩盖了不同细胞亚群之间的异质性。近年来出现的单细胞测序技术,使我们能够从单个细胞水平,区分样本中的细胞类型、发现新的细胞亚群、揭示各亚群的不同生物学功能、研究细胞状态变化以及细胞间相互作用,从更高的分辨率揭示肿瘤内异质性及肿瘤微环境特点,剖析肿瘤内部的分子特征,从而指导肿瘤的精准治疗。研究目的利用单细胞转录组测序技术,探寻肝细胞癌合并门静脉癌栓患者的肿瘤异质性,以及肿瘤组织和门静脉癌栓肿瘤微环境的异同,挖掘两者共有及特有的潜在治疗靶点。研究对象及方法对5例肝细胞癌合并门静脉癌栓患者的肿瘤组织及配对门静脉癌栓样本进行单细胞转录组测序,对肿瘤细胞、基质细胞和免疫细胞分群,分析各亚群在不同样本来源中数目变化、基因表达差异和细胞通讯网络的异同。并采用实时定量聚合酶链式反应、蛋白免疫印迹、构建稳定表达目标基因的细胞系、细胞共培养、裸鼠皮下荷瘤、免疫组化染色和多重免疫荧光染色等方法对目标基因和相关细胞亚群进行研究。研究结果我们共获得了35177个单细胞转录组数据集,构建了该类患者的全景细胞图谱。其中,肿瘤细胞被分为4个亚群,分别具有不同的药物靶点表达情况,独特的代谢激活模式以及特异的转录因子调控模式。同样的,各基质细胞亚群也具有截然不同的代谢激活模式。通过对细胞亚群的克隆演化分析,我们观察到肿瘤相关成纤维细胞、静脉内皮细胞及中性粒细胞具有多个分化方向。通过利用细胞亚群标记基因进行多基因预后分析,我们发现,中性粒细胞亚群中的补体相关亚群可能和患者良好的预后相关。在对比肿瘤组织及门静脉癌栓的肿瘤微环境后,我们发现,在不同的肿瘤微环境中,一些关键细胞亚群的数目、基因表达模式及代谢激活模式出现了改变。肿瘤细胞均以高侵袭性亚群及惰性亚群为优势亚群,但门静脉癌栓中高侵袭性亚群细胞比例增加。仑伐替尼靶点相关的基因表达在门静脉癌栓中的部分肿瘤亚群中升高。基质细胞中绝大部分亚群在门静脉癌栓环境中促血管生成的相关基因表达量升高。门静脉癌栓中肿瘤相关成纤维细胞明显增多,且炎性相关的亚群转变为优势亚群。在内皮细胞中,我们发现一类补体相关静脉内皮细胞,几乎只在肿瘤组织内出现。该亚群是所有内皮细胞中表达BMP4最高的亚群,而重组BMP4可增强白细胞跨内皮迁移。故我们推测该亚群在门静脉癌栓中的数量减少可能与该环境里中性粒细胞数量下降有关。免疫细胞方面,尽管PVTT中浸润的中性粒细胞较肿瘤组织中明显减少,但IL1B表达上调,微环境炎症状态并未相应减轻。T细胞在门静脉癌栓中浸润数量增加,但和NK细胞的情况类似,大部分细胞毒相关的亚群或数量下降,或免疫抑制相关基因上调,降低了其抗肿瘤效应。总之,和肿瘤组织相比,门静脉癌栓中的免疫抑制状态加重。通过分析代谢相关基因集的激活情况,我们观察到,绝大部分免疫细胞的代谢状态在肿瘤组织及门静脉癌栓中无变化。但大多数肿瘤细胞及基质细胞亚群的糖酵解、脂质摄取或脂质合成的相关基因集在门静脉癌栓环境中明显激活,上述细胞代谢过程及代谢产物的改变,可能参与了对肿瘤微环境的重塑,并加重了门静脉癌栓中的免疫抑制。通过采用Cell Phone DB数据库进行不同细胞亚群间的配体-受体分析,我们发现肿瘤组织及门静脉癌栓环境中几条潜在的由肿瘤细胞、基质细胞和免疫细胞共同参与的正反馈环,驱动着不同肿瘤微环境中不同肿瘤亚群的进展。我们发现肿瘤组织和门静脉癌栓中肿瘤细胞的优势亚群Tumor＿4亚群高表达多个抑癌基因,推测可能在该亚群的标记基因中,发掘出其他抑制肝细胞癌侵袭的基因。通过一系列筛选流程,最后我们选择了CFHR3进行研究。该基因高表达和肝细胞癌患者良好预后相关。通过分析临床样本,发现该基因在癌旁组织中表达高于肿瘤组织和门静脉癌栓。体内及体外实验证实,该基因过表达可抑制肝细胞癌细胞生长、迁移、侵袭、上皮-间充质转化和肿瘤血管生成。通过对其机制研究,我们发现,该基因过表达通过抑制p38磷酸化,从而遏制肿瘤细胞的上皮-间充质转化。研究结论利用单细胞转录组测序技术,我们绘制了肝细胞癌合并门静脉癌栓患者的全景细胞图谱,揭示了肿瘤组织及门静脉癌栓中的肿瘤异质性以及肿瘤微环境中的变化。肿瘤组织和门静脉癌栓的肿瘤微环境中存在免疫抑制梯度,后者免疫抑制状态重于前者。通过研究特定肿瘤细胞亚群的标记基因,我们发现CFHR3在肝细胞癌中具有抑癌作用。该基因过表达可抑制肝细胞癌细胞生长、迁移、侵袭、上皮-间充质转化和肿瘤血管生成。这项研究为肝细胞癌的治疗提供了潜在的治疗靶点。