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石斑鱼(Epinephelus tauvina)是重要的海水养殖鱼类,具有较高经济价值,已经成为我国重要的海水鱼类养殖品种。在世界许多地区,由病毒如虹彩病毒引起的疾病已呈明显上升趋势,致使许多地方人工养殖的石斑鱼出现大面积死亡,从而造成了严重的经济损失。通过对石斑鱼类免疫因子的研究能够揭示病毒和宿主免疫系统的相互作用,从而为渔业生产提供帮助。
通过设计兼并引物,利用快速扩增cDNA末端(rapid amplification of cDNAends,RACE)技术,从石斑鱼中克隆得到了新基因序列,通过和NCBI数据库的数据比对,确定获得了石斑鱼白介素增强子结合因子2(jnterleukin enhancerbinding factor 2,ILF2)全长cDNA序列。该石斑鱼ILF2的开放阅读框编码了387个氨基酸的蛋白质,与核酸合成和蛋白表达相关,是首次在石斑鱼体内发现。
通过构建系统进化树,发现石斑鱼ILF2与已经报道的其他鱼类ILF2进化距离较近,表明ILF2在进化上具有保守性,而不同物种的ILF2基因序列又有一定的差别,显示了他们的变异区在进化上存在较明显的差异性。生物信息学分析ILF2能在细胞内表达具有多个酶切位点,多个功能位点的可溶性蛋白。
为了研究石斑鱼ILF2在宿主和病毒相互作用过程中的作用机制,本研究应用半定量PCR技术,分析了ILF2在鱼体中的组织分布和在感染石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)不同时段各组织器官中的时空表达情况。结果表明,石斑鱼ILF2在相同时间点具有较保守的组织表达趋势,在不同的时间点存在较明显的波动变化。同时也发现ILF2的表达和病毒的复制有一定的关系。使用实时定量PCR(ReaRime PCR,RT-PCR)研究SGIV感染GP细胞(Grouper cellsline)后,ILF2随SGIV的病毒主要衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)的表达情况。结果显示SGIV MCP在GP细胞表达量较低时,ILF2的表达量较高,反之,在SGIV MCP表达量高时,ILF2的表达量降低,表明SGIV感染复制可抑制ILF2的表达。而在SGIV感染的石斑鱼脾组织和其它五个组织中的表达分析显示了ILF2和MCP之间可能存在一定的相互作用。本论文构建了ILF2的表达载体,并初步进行了原核表达试验,证明了已构建的pET-ILF能够表达蛋白,但还需要一些实验鉴定所表达的蛋白,以便为下一步进行信号通路和细胞定位研究奠定基础。