双生病毒是一类在全球范围广泛发生的植物病毒,在多种重要经济作物上已造成重大损失。双生病毒基因组为单链环状DNA,病毒链和互补链可以编码6-8个蛋白,分别参与病毒基因组DNA复制、转录、组装、移动和介体昆虫传播等过程。双生病毒在寄主细胞的细胞核内借助寄主的DNA聚合酶和一些寄主因子,主要通过滚环复制的方式复制其基因组DNA。双生病毒复制需要Rep（AC1/AL1/C1）和REn（AC3/AL3/C3）两个病毒蛋白的参与,其中,Rep是病毒复制所必需的蛋白,REn虽有报道其能增强双生病毒DNA在寄主内的复制,但目前对REn参与病毒复制的作用细节研究较少,REn调控的寄主因子和作用机制,对寄主内源基因表达的影响,以及寄主因子表达对病毒侵染的影响等问题尚不明确。烟草曲茎病毒（tobacco curly shoot virus,TbCSV）是Geminiviridae科Begomovirus属的单组份病毒,是我国云南、四川等地的烟草和番茄曲叶病的主要病原。本研究以TbCSV编码的C3蛋白为研究对象,在本氏烟（Nicotiana benthamiana）中借助马铃薯X病毒（potato virus x,PVX）介导基因表达、侵染性克隆构建技术、农杆菌介导遗传转化及高通量测序等研究方法及生物信息学分析软件,重点研究TbCSV编码的C3蛋白对病毒复制和寄主表型的影响;解析C3蛋白参与调控的寄主因子及其对TbCSV侵染的影响,探讨C3蛋白与寄主因子之间的互作关系。本论文的主要研究结果如下:1.TbCSV编码的C3蛋白对病毒复制的影响以TbCSV的侵染性克隆为研究材料,采用定点突变的方法,对TbCSV的C3 ORF两个潜在起始密码子进行突变,该突变体C3蛋白无法表达,但不影响与C3序列部分重叠的C2 ORF的正常表达。构建该突变体的侵染性克隆TbCSVΔC3,借助农杆菌浸润法接种本氏烟,以接种野生型TbCSV(TbCSVWT)的本氏烟为对照。结果发现,在接种后5天（days post inoculation,dpi）,TbCSVWT系统侵染的本氏烟新叶开始表现卷曲症状,但TbCSVΔC3侵染的本氏烟新叶未表现症状。随着接种时间延长,在15 dpi,TbCSVΔC3和TbCSVWT系统侵染的本氏烟均出现卷叶、茎秆扭曲和植株矮化症状,二者症状无明显差别。TbCSVΔC3系统侵染本氏烟后引起叶片上卷、矮化、茎秆扭曲等类似野生型TbCSV侵染的典型症状,TbCSVΔC3与TbCSVWT均能引起本氏烟约100%的检出率,表明C3蛋白不影响病毒的侵染效率。病毒DNA积累水平检测结果表明,在5 dpi、10 dpi、15 dpi,TbCSVΔC3在本氏烟系统叶中的积累水平低于TbCSVWT的DNA积累水平,在侵染后期（20 dpi）,二者的DNA积累水平无明显差别。以上结果表明C3蛋白缺失能够降低TbCSV DNA在本氏烟中的复制,且侵染早期（5 dpi）能够延缓病毒在本氏烟上的病毒症状。扩增TbCSVΔC3侵染的本氏烟内病毒基因组DNA,测序后序列比对结果表明,定点突变的两个ATG序列未发生回复。2.过表达C3蛋白对TbCSV侵染的影响为明确C3蛋白过表达对TbCSV侵染的影响,构建C3的系统表达载体PVX-C3和瞬时表达载体p CV-C3,转化农杆菌;利用叶盘法获得C3过表达的转基因本氏烟,挑战接种TbCSVWT和TbCSVΔC3。结果发现,在7 dpi,PVX介导的C3蛋白表达可以增强PVX在本氏烟上的花叶症状,促进PVX在本氏烟内的积累。此外,C3蛋白还能促进TbCSV DNA在本氏烟内的积累。在C3瞬时过表达的本氏烟叶片中,在接种后48小时（hours post inoculation,hpi）,TbCSVWT和TbCSVΔC3的DNA积累水平均显著性高于野生型本氏烟中的病毒积累水平。同时,接种TbCSVΔC3的本氏烟接种叶中病毒DNA积累量显著低于TbCSVWT的接种叶。病毒基因表达分析结果表明,C3过表达的本氏烟叶片中,TbCSV病毒链C1、C4和互补链V1、V2基因的表达水平高于对照组,表明C3蛋白表达能够促进TbCSV在本氏烟接种叶中的积累和病毒基因的表达。过表达C3转基因本氏烟经过阳性植株筛选,与野生型本氏烟的生长状况相比较,C3过表达对植株正常生长没有造成明显的影响。TbCSVWT和TbCSVΔC3接种实验结果表明,在7 dpi和14 dpi,接种TbCSVWT和TbCSVΔC3的转C3基因本氏烟中,TbCSVWT和TbCSVΔC3的DNA积累水平均显著高于野生型本氏烟。以上结果表明C3蛋白稳定表达不影响本氏烟的表型,但是能够促进TbCSV在本氏烟植株中的积累。3.C3调控的寄主因子筛选为进一步了解C3蛋白调控的寄主因子及其在寄主体内的作用细节,将TbCSVWT和TbCSVΔC3分别接种本氏烟,进行转录组测序。基于转录组测序结果表明,两个处理的样品中分别鉴定出43370和43239条基因,其中,已知基因分别为40353（67.46%）条和40220（67.24%）条,鉴定新基因分别为3017条和3019条。FPKM分布结果表明这些样品中基因表达情况良好。鉴定的所有基因中,有23条基因显著性差异表达,其中16条下调,7条上调。这些差异表达的23条基因分别富集到15个GO term,其中上调表达的16条基因显著富集到15个,下调表达的9个基因富集到9个GO term。KEGG富集分析结果显示这些差异表达基因分别富集到硫代谢、昼夜节律、寄主抗病性、超氧化物酶、泛素化介导的蛋白质降解、植物与病原互作和微生物代谢等过程相关。随机筛选了14条基因用q RT-PCR进行验证,结果表明其中12条基因,转录组测序结果与q RT-PCR结果一致,表明转录组测序结果准确。进一步的分析表明,本氏烟NbNAC2基因在TbCSVWT和TbCSVΔC3侵染的本氏烟中显著性差异表达,表明NbNAC2基因的表达可能受到C3蛋白的调控。4.NbNAC2表达对TbCSV侵染的影响为进一步明确NbNAC2与C3蛋白的关系,以及NbNAC2表达对TbCSV侵染的影响。采用q RT-PCR分析NbNAC2在本氏烟不同组织中的表达水平,结果表明,NbNAC2在本氏烟叶片中积累量最高,花中次之,而在根和茎的积累量较低。构建了C3蛋白和NbNAC2的C端融合GFP的植物瞬时表达载体,以GFP空载体为对照。经农杆菌浸润接种本氏烟,48 h后于激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光表达情况。结果表明,NbNAC2和C3蛋白均主要定位于细胞核。利用酵母双杂交技术,构建C3和NbNAC2的酵母表达载体,共转化AD-C3和BK-NbNAC2于酵母菌株,结果表明NbNAC2和C3蛋白存在互作。在此基础上,通过Bi FC进一步验证NbNAC2和C3蛋白的互作情况。将NbNAC2和C3基因克隆至含有YFP蛋白的N端或C端的荧光表达载体,经农杆菌浸润接种和共聚焦显微镜观察分析,结果表明NbNAC2和C3蛋白在本氏烟中存在互作,DAPI染色结果表明互作位点定位于本氏烟叶片细胞核。利用q RT-PCR检测不同接种时间TbCSVΔC3和TbCSVWT侵染的本氏烟中NbNAC2基因的表达情况,以及C3过表达转基因植株中NbNAC2基因的表达情况。结果表明,在5 dpi,接种TbCSVWT的本氏烟中NbNAC2表达水平低于未接种的本氏烟,但接种TbCSVΔC3的本氏烟与未接种的本氏烟NbNAC2表达水平相当。在10 dpi,TbCSVΔC3侵染的本氏烟中NbNAC2表达水平低于TbCSVWT,但是接种TbCSVΔC3和TbCSVWT的本氏烟中NbNAC2表达水平均高于未接种本氏烟。在15 dpi,TbCSVΔC3接种的本氏烟中NbNAC2表达水平与对照组相当,均显著低于TbCSVWT。在过表达C3蛋白的转基因本氏烟植株中,NbNAC2的表达量均显著高于野生型本氏烟。表明NbNAC2的表达受TbCSV侵染的影响,且受C3蛋白的调控。为进一步明确NbNAC2表达对本氏烟生长发育和TbCSV侵染的影响,分别构建NbNAC2基因沉默载体及超表达载体,分别转化农杆菌,接种本氏烟,并挑战接种TbCSV。结果表明,在7 dpi,PVX介导NbNAC2过表达引起本氏烟新叶表现明显的叶片上卷症状,在14 dpi,接种PVX-NbNAC2的本氏烟植株出现坏死症状。基因表达分析结果表明,PVX介导NbNAC2的表达量被上调了大约10,000倍。在NbNAC2瞬时过表达的本氏烟叶片中,TbCSVWT的积累水平高于对照组,但是接种TbCSVΔC3的本氏烟中病毒积累水平与对照无明显差异。TRV介导的NbNAC2基因沉默对本氏烟的表型无明显影响,挑战接种TbCSV结果表明,NbNAC2基因沉默的本氏烟中TbCSVWT的积累水平降低。以上结果表明,过表达NbNAC2基因能够促进TbCSVWT的DNA积累,但是不能促进TbCSVΔC3的积累,沉默NbNAC2基因能够抑制本氏烟叶片中TbCSV的DNA积累。综上所述,本研究以TbCSV编码的C3蛋白为研究对象,发现C3蛋白能够促进TbCSV在本氏烟中的积累和病毒基因的表达,影响侵染早期病毒的症状形成;C3蛋白能够与本氏烟NbNAC2互作并调控NbNAC2的表达,从而影响TbCSV的积累。这些研究结果为进一步解析C3蛋白在调控寄主因子表达从而调控双生病毒复制中的作用机理奠定了良好的基础。