【摘 要】
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目的:本课题通过观察抑肺饮对Lewis肺癌荷瘤小鼠的抑瘤作用和调控EMT的影响,拟通过体内外水平实验测定EMT标志物E-cadherin、vimentin表达情况,来研究抑肺饮对上皮间质转化的调控作用,阐明抑肺饮抗转移作用的机制。方法:1.动物实验:将70只C57BL/6J小鼠随机分为7组:正常小鼠空白组,荷瘤模型空白对照组,顺铂组,抑肺饮中剂量加顺铂组（中药加顺铂组）,抑肺饮高、中、低剂量组。采
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目的:本课题通过观察抑肺饮对Lewis肺癌荷瘤小鼠的抑瘤作用和调控EMT的影响,拟通过体内外水平实验测定EMT标志物E-cadherin、vimentin表达情况,来研究抑肺饮对上皮间质转化的调控作用,阐明抑肺饮抗转移作用的机制。方法:1.动物实验:将70只C57BL/6J小鼠随机分为7组:正常小鼠空白组,荷瘤模型空白对照组,顺铂组,抑肺饮中剂量加顺铂组（中药加顺铂组）,抑肺饮高、中、低剂量组。采用C57BL/6J小鼠,于右侧腋窝建立Lewis荷瘤小鼠模型。经过不同处理,连续2周,停药24hr后处死小鼠,解剖取瘤、称重,分别计算肿瘤抑制率及增效率;免疫组化法检测瘤细胞表面E-cadherin和vimentin蛋白表达率;提取肺癌移植瘤总RNA,qRT-PCR法检测瘤细胞E-cadherin和vimentin mRNA的表达水平,探讨抑肺饮对肺癌细胞EMT的影响。2.细胞实验:制备抑肺饮含药血清,应用TNF-α诱导肺癌A549细胞发生EMT,采用不同浓度的抑肺饮含药血清、空白血清组和TNF-α/NF-κB抑制剂Bay 11-7082进行干预,对含药血清的功能进行评价;Western blot检测EMT标志物 E-cadherin、vimentin 蛋白表达情况,qRT-PCR 法检测 E-cadherin、vimentin mRNA的表达水平。结果:1.动物实验结果显示:（1）抑肺饮高剂量组和中药加顺铂组小鼠的一般情况较模型组好;顺铂组、中药加顺铂组、低剂量组、中剂量组和高剂量组的抑瘤率分别为31.79%,37.58%,1.25%,21.81%,31.71%;中药加顺铂组增效率Q值是1.21。（2）抑肺饮中剂量组、抑肺饮高剂量组、顺铂组及中药加顺铂组瘤细胞表面E-cadherin和vimentin蛋白的平均积分光密度与模型组相比差异有统计学意义（P＜0.05）,低剂量与其相比相差不明显,且无统计学意义（P=0.252和0.520）。（3）肺癌移植瘤E-cadherin和vimentinmRNA的表达:与模型组相比,各用药组的上皮标志物E-cadherin mRNA表达呈上升趋势,而vimentin mRNA的表达呈下调状态,顺铂组、高剂量及中药加顺铂组与模型组相比有显著统计学意义（P＜0.01）,而中、低剂量组与模型组无统计学差异。2.细胞实验表明:（1）当TNF-α作用于肺癌A549细胞96hr后,观察到其细胞形态出现明显变化,由扁圆梭形上皮变为成纤维样、明显拉长的纺缍形间质形态,同时代表上皮表型的E-cadherin蛋白表达明显下降,而代表间质表型的vimentin蛋白表达明显升高,提示应用TNF-α诱导A549细胞发生EMT。（2）细胞迁移及侵袭表明:与对照组相比经TNF-α诱导后,细胞迁移能力明显增强,含药血清各组均能抑制A549细胞的侵袭及迁移能力,其中抑肺饮高剂量组对A549的侵袭及迁移作用抑制最强。（3）通过MTT法检测抑肺饮高剂量、中剂量和低剂量含药血清对A549细胞增殖的影响,实验结果表明:在3个不同浓度的3组含药血清中,5%浓度含药血清整体上比10%、20%的抑制率高,总的来说,高剂量比中剂量、低剂量的抑制效果好。（4）含药血清对A549细胞EMT相关蛋白mRNA相对表达的影响:首先,TNF-α组与对照组相比vimentin mRNA上升而E-cadherin mRNA下降,说明成功应用TNF-α诱导A549细胞发生EMT;各实验组与对照组相比,各组的上皮标志物E-cadherin mRNA表达呈上升趋势,而vimentin mRNA的表达呈下调状态,Bay 11-7082抑制剂组、高剂量与对照组、TNF-α组相比有显著统计学意义（p＜0.05）,而中、低剂量组与其无统计学差异。（5）Western blot检测抑肺饮对EMT标志物的影响,含药血清与空白组血清相比,上皮细胞标志物E-cadherin的蛋白表达水平呈上调状态,而间质细胞标志物Vimentin呈下调状态。结论:1.抑肺饮高剂量组对Lewis肺癌荷瘤小鼠有一定的抑瘤作用,中药联合顺铂具有一定的协同作用。2.抑肺饮在体内外可抑制肿瘤细胞EMT的发生,降低癌细胞的侵袭转移能力。3.抑肺饮中、高剂量组血清可抑制肺癌转移,对肺癌转移的关键环节:肿瘤细胞增殖、肿瘤细胞迁移和侵袭均有不同程度的作用。
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