【摘 要】
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目的本课题分为三部分。第一部分,探索并确证可以用于诊断和治疗未分化型甲状腺癌的特异性分子标记物及靶点;第二部分,快速筛选靶向治疗未分化型甲状腺癌的高效低毒性的核酸适配体;第三部分,探究核酸适配体药物偶联体的制备及其药物毒性作用。方法第一部分,我们以既往文献和实验数据为基础,利用RT-PCR、免疫组化及免疫荧光法等方法探索及确证未分化型甲状腺癌的特异性分子标记物（如CD家族蛋白及其他膜蛋白）;第二部
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目的本课题分为三部分。第一部分,探索并确证可以用于诊断和治疗未分化型甲状腺癌的特异性分子标记物及靶点;第二部分,快速筛选靶向治疗未分化型甲状腺癌的高效低毒性的核酸适配体;第三部分,探究核酸适配体药物偶联体的制备及其药物毒性作用。方法第一部分,我们以既往文献和实验数据为基础,利用RT-PCR、免疫组化及免疫荧光法等方法探索及确证未分化型甲状腺癌的特异性分子标记物（如CD家族蛋白及其他膜蛋白）;第二部分,通过Cell-SELEX筛选方法,即通过瞬时转染质粒技术,以过表达CD133蛋白的HEK-293T细胞为阳性细胞,正常的HEK-293T细胞为阴性细胞,经过三轮筛选后得到高亲和力的ssDNA文库并通过高通量测序的方法对文库中的序列进行分析。最后通过流式细胞术检测筛选出的核酸适配体的亲和性,从而获得高亲和性高特异性的CD133靶向核酸适配体;第三部分,我们碳氮双键和酰胺键为连接键,将抗肿瘤药物阿霉素（Dox）与linker,即3-（2-吡啶二巯基）丙酸（SPDP）相连,通过MTT法检测药物与linker偶联前后对细胞的毒性变化。结果第一部分,正常甲状腺细胞组织和细胞Nthy-ori3-1不表达CD133蛋白,未分化型甲状腺癌组织和细胞FRO表达CD133蛋白且表达于细胞膜上;第二部分,根据高通量测序及流式细胞术实验综合分析后认为核酸适配体AP-1的亲和性最好,其吉布斯自由能为-8.38kcal/mole,解离平衡常数Kd值为13.7nM;通过免疫荧光法发现,AP-1可以和过表达CD133蛋白的HEK-293T细胞结合并结合于细胞膜上,而与正常的HEK-293T细胞不结合;AP-1可以和未分化型甲状腺癌细胞株FRO结合于细胞膜上并被内吞入胞内;第三部分,MTT法结果显示和Dox相比,Dox-SPDP依然具有抗肿瘤作用,但其抗肿瘤作用有所降低。结论第一部分:CD133蛋白能够作为未分化型甲状腺癌较好的特异性分子标记物及靶点之一。第二部分:AP-1是筛选出的特异性结合CD133蛋白且具有高亲和性的核酸适配体,并且可以和未分化型甲状腺癌细胞株FRO结合于细胞膜上并被内吞入胞内从而达到靶向输送的目的。第三部分:相比于Dox,Dox-Spdp偶联物依然具有药物毒性,后续可与Aptamer偶联合成Dox-Spdp-Aptamer偶联物进行更进一步的探究。
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