目的:E蛋白是一个新型膜蛋白,本实验室前期通过蛋白组学分析,发现E蛋白与耐药蛋白P-gp存在相互作用。本课题将在乳腺癌组织中评价E蛋白及耐药蛋白P-gp的表达,分析E蛋白与耐药蛋白P-gp以及临床病理指标的相关性。同时,构建原代乳腺癌细胞培养方法,分析原代乳腺癌细胞中E蛋白的表达及定位与药物敏感性的关系。此外,为更好的反应原代乳腺癌细胞对药物的敏感性,我们将进一步比较二维及三维培养条件下,原代乳腺癌细胞的药物敏感性情况,并分析E蛋白的表达与三维培养环境中药物敏感性的关系。方法:1、利用免疫组化方法对87例乳腺癌患者进行指标染色,检测E蛋白及耐药蛋白P-gp的表达量,并分析E蛋白蛋白表达与耐药蛋白P-gp及临床病理之间的相关性。2、构建乳腺癌原代细胞培养方法,得到纯度较高的原代乳腺癌细胞。3、采用MTT方法检测不同患者来源的原代乳腺癌细胞对化疗药物(阿霉素和顺铂)的敏感性。4、采用Western Blot方法检测不同患者来源的原代乳腺癌细胞中E蛋白的表达量,分析原代乳腺癌细胞中E蛋白的总体表达量与药物敏感性的关系。5、采用免疫荧光方法,观察对药物敏感性不同的原代乳腺癌细胞中E蛋白与耐药蛋白P-gp的表达及定位情况。6、构建Matrigel三维细胞培养方法,研究E蛋白表达水平与三维环境下药物敏感性的关系。结果:1、乳腺癌组织中,E蛋白可以表达于胞膜、胞质、胞核中,E蛋白在膜浆的表达量与耐药蛋白P-gp呈更明显的相关性。且在E蛋白膜浆高表达组中,luminal型乳腺癌所占比例较高。2、通过胶原酶消化乳腺癌组织,梯度离心法及差异消化法进一步纯化,建立原代乳腺癌细胞培养方法,成功培养原代乳腺癌细胞标本28例,其中20例获得足够数量的状态良好的细胞进行后续实验。3、对20例患者来源的原代乳腺癌细胞的总蛋白通过Western Blot方法,检测了原代乳腺癌细胞内总体E蛋白表达水平,并计算了E蛋白/GAPDH值将患者分为E蛋白高表达组和E蛋白低表达组。4、20例患者中,对16例患者来源的原代乳腺癌细胞进行了对阿霉素的药物敏感性检测,12例进行了对顺铂的药物敏感性检测,并计算出IC50值。E蛋白表达水平与药物敏感性数据结合分析显示,在对DDP的药物敏感性中,E蛋白总体水平高表达组,对顺铂的敏感性减低,耐受性增强;在对ADR的药物敏感性中,两组中无明显差异。5、免疫荧光实验发现,在相对耐药的患者中,E蛋白主要定位于胞膜上,同耐药蛋白P-gp存在明显胞膜共定位关系;在对药物相对敏感的患者中,E蛋白在胞膜表达明显减少,同耐药蛋白P-gp无明显共定位。6、三维环境中原代乳腺癌细胞对药物的敏感性降低,在对药物相对耐受的病例中,E蛋白主要表达于胞膜上,且E蛋白及耐药蛋白P-gp均高表达,反之亦然。结论:1、乳腺癌组织中,E蛋白可以表达于胞膜、胞质、胞核中,E蛋白胞膜胞浆表达量与耐药蛋白P-gp呈更明显相关性。且在膜浆高表达组中,luminal型乳腺癌所占比例较高。2、原代乳腺癌细胞中,E蛋白总体表达水平与药物敏感性无明显相关性,表达于胞膜上的E蛋白调控耐药蛋白P-gp的表达,影响细胞对药物的敏感性。3、三维培养方法更能反应原代肿瘤细胞对药物的敏感性,在三维环境中也表现出胞膜E蛋白高表达,细胞耐药性增强,进一步验证了二维培养条件下的结果。