棉花黄萎病是由大丽轮枝菌引起的典型维管束病害,严重威胁着棉花的品质和产量,素有棉花的“癌症”之称。当前,天然陆地棉中几乎不存在高抗黄萎病的种质资源,一旦病原菌进入植物体内便无有效的治疗措施。基因工程是提高棉花自身抗病性的潜在手段,然而高效抗性基因的缺乏限制了棉花抗黄萎病工程的发展。球孢白僵菌是一种应用广泛的杀虫真菌。除能够致死昆虫外,球孢白僵菌还能与植物互作,抑制真菌病害的发生,因此逐渐成为挖掘植物抗病基因的良好资源。课题组前期从球孢白僵菌中克隆得到一个抗菌肽基因BbAFP1,该基因编码的产物对包括大丽轮枝菌在内的多种植物病原真菌具有明显的抑制作用,推测可将其应用于植物抗病基因工程。但目前对BbAFP1的抑菌机理、在球孢白僵菌中的生物学功能、能否提高棉花对黄萎病的抗性等均不清楚。针对上述问题,本论文首先分析了BbAFP1与真菌细胞壁的结合,对病原真菌膜电势、活性氧和细胞膜通透性的影响,阐明其抑菌机理;其次,观察了BbAFP1在球孢白僵菌生长发育过程中表达及定位情况,比较了野生型菌株（WT）、BbAFP1超量表达菌株(BbAFP1OE)、BbAFP1敲除菌株（（35）BbAFP1）对病原真菌的拮抗能力,分析其可能的生物学功能;最后,为进一步提高BbAFP1的抗病能力,在其羧基端融合了能靶向真菌细胞壁或细胞膜特定成分的结合域,将构建好的融合抗菌肽基因导入到棉花和烟草中,获得抗病能力显著提高的转基因材料。论文的主要结果如下:1、BbAFP1的蛋白特性抑菌谱分析显示,BbAFP1对尖孢镰刀菌、稻瘟病菌、大丽轮枝菌、番茄早疫病菌、禾谷镰刀菌、灰葡萄孢菌、油菜黑斑病菌的孢子萌发及菌丝生长具有明显的抑制作用,但是对细菌和酿酒酵母的生长没有影响。BbAFP1对植物病原真菌的最低抑制浓度（MIC）主要集中在5-15μM,其中对尖孢镰刀菌的MIC最低（5μM）。热稳定检测结果显示,BbAFP1是一个耐热性能优良的蛋白,100℃处理2 h,抑菌活性几乎没有变化;100℃处理4-6 h,仍能保持70-80%的抑菌活性。活性分析进一步发现,BbAFP1在酸性条件下抑菌效果更强。2、BbAFP1的抑菌机理用荧光分子FITC（异硫氰酸荧光素）标记纯化的BbAFP1,进行抑菌机理分析。结合实验显示,BbAFP1能与植物病原真菌细胞壁上的几丁质结合。为分析可能参与几丁质结合的关键氨基酸及几丁质结合对BbAFP1抑菌活性的影响,将BbAFP1中的芳香族氨基酸（Y37、F50、F59、Y74、Y79和Y37&F50）突变成丙氨酸,获得不同的突变体抗菌肽。结合及活性检测结果显示,将BbAFP1的第50位苯丙氨酸突变成丙氨酸后(BbAFP1F50A),其与粉末几丁质及真菌细胞壁的结合能力显著下降;与野生型相比,BbAFP1F50A抑菌活性明显降低,MIC较野生型抗菌肽提高了3-5倍。以上结果表明,BbAFP1第50位苯丙氨酸在其几丁质结合能力及抑菌活性中起着重要作用。利用Di SC3（5）、H2DCFDA和PI染料检测BbAFP1处理油菜黑斑菌后膜电势、活性氧及细胞膜完整性的变化情况。结果显示,处理2 min就能在溶液中检测到膜上释放出来的Di SC3（5）的信号,表示膜电势发生了改变;处理5 min,体内能够检测到强烈的H2DCFDA荧光信号,表明有大量活性氧产生;处理60 min,BbAFP1信号和PI信号在胞内发生重叠,表明细胞膜发生了破裂。以上结果表明,BbAFP1利用其几丁质结合能力富集到病原真菌表面,随后引发膜电势改变及活性氧爆发,最终引起细胞膜破裂。3、BbAFP1在球孢白僵菌中的生物学功能BbAFP1氨基酸序列中包含有分泌信号肽,推测其在球孢白僵菌拮抗环境真菌的过程中被分泌到胞外,抑制其它真菌的生长。但对PBbAFP1::e GFP菌株的荧光分析发现,BbAFP1的表达不受真菌的诱导,其仅在孢子成熟阶段表达。进一步对PBbAFP1::BbAFP1::e GFP菌株的荧光分析发现,BbAFP1并未分泌到环境中,而是定位于孢子细胞壁上。超声波处理该菌株孢悬液后,孢子细胞壁上的GFP信号明显减弱,而溶液中的荧光强度明显增强。观察PBbAFP1::BbAFP1::e GFP菌株孢子在萌发及生长过程中荧光变化,发现孢壁上的GFP信号在接种6 h后逐渐减弱,在12 h后消失。Western blot及ELISA实验发现,BbAFP1在孢子萌发过程释放到了溶液中。为分析BbAFP1在孢子成熟阶段特异表达并结合到孢子细胞壁上的生物学意义,构建了BbAFP1基因的敲除及超量表达菌株。将上述菌株与油菜黑斑菌或木霉进行共培养,分析不同菌株对其它真菌的抑制效果。结果显示,WT和BbAFP1OE菌株对共培真菌的生长有明显的抑制作用,而敲除BbAFP1则显著降低这种抑制效果。以上结果表明,球孢白僵菌在孢子成熟阶段表达BbAFP1,并将其“预装”在细胞壁上。当遇到适宜的环境,孢壁上的BbAFP1被释放到环境中,抑制其它真菌的生长,保障球孢白僵菌能获得足够的营养及空间完成自身的生长发育。4、BbAFP1的定向改良研究发现,在番茄中超量表达BbAFP1可以增强植株的抗病能力。为进一步提高其抗病活性,分别在BbAFP1上融合能与真菌几丁质结合的Ch BD、与鞘脂结合的Sp BD以及与麦角甾醇结合的Er BD,并通过农杆菌介导的瞬时表达技术初步评价了各融合抗菌肽在植物中的抑菌效果。结果显示,表达BbAFP1::Er BD的棉花子叶对大丽轮枝菌的抗性最强,其病情指数为27;而表达BbAFP1::Sp BD和BbAFP1::Ch BD的棉花子叶病情指数分别为32.5和46.8。进一步在棉花和烟草中瞬时表达结果发现,相比单独的BbAFP1和Er BD,融合抗菌肽BbAFP1::Er BD对大丽轮枝菌和灰葡萄孢菌具有更强的抑菌活性。5、利用BbAFP1::Er BD提高棉花及烟草的抗病能力为评价融合抗菌肽基因BbAFP1::Er BD在植物抗病基因工程上的应用潜力,经遗传转化及分子验证获得了表达融合基因BbAFP1::Er BD和野生型基因BbAFP1的转基因棉花及烟草。利用不同的抗病鉴定方法对转基因后代进行抗性分析,发现:1)T0代转基因棉花离体叶片接种大丽轮枝菌后,目的基因表达水平相近的株系中,BbAFP1::Er BD转基因株系叶片上的病斑面积显著小于BbAFP1;2)T2代转基因棉花离体叶片接菌实验结果显示,相比表达野生型BbAFP1的株系BbAFP1-35,表达融合基因的植株（BbAFP1::Er BD-61）对大丽轮枝菌和灰葡萄孢菌都表现出更强的抗病能力;3)利用根浸法对T2代转基因棉花植株接种大丽轮枝菌后,野生型棉花植株叶片上出现严重的黄萎病症状,而转基因棉花株系BbAFP1-35和BbAFP1::Er BD-61的病症明显减轻。相较株系BbAFP1-35,表达融合基因的棉花材料病症更轻;4)T0代转基因烟草离体叶片接种大丽轮枝菌后,BbAFP1::Er BD转基因株系叶片的病情指数显著低于BbAFP1。这些结果表明,构建的融合基因对大丽轮枝菌和灰葡萄孢菌有较高的抗病能力。6、BbAFP1::Er BD抑菌的机理检测接菌前后棉花内源病程相关蛋白基因（PR）的表达水平发现,表达BbAFP1或BbAFP1::Er BD不会影响植株内源PR基因表达。转基因棉花总蛋白处理大丽轮枝菌1 h后,利用免疫荧光观察BbAFP1和BbAFP1::Er BD在真菌上的定位。结果显示,BbAFP1主要结合在菌丝表面,而BbAFP1::Er BD在菌丝表面呈片状分布,并出现在菌丝内部。PI染色结果证实,相比BbAFP1,BbAFP1::Er BD转基因棉花总蛋白处理大丽轮枝菌后的细胞膜更容易破裂,表明BbAFP1::Er BD能够加快细胞膜的破裂。此外,利用表达GFP的大丽轮枝菌（V991-GFP）接种棉花根系6 d后发现,相比野生型和表达BbAFP1的棉花,BbAFP1::Er BD转基因棉花根系中定植的荧光菌丝含量更少,表明BbAFP1::Er BD能够更有效的抑制大丽轮枝菌在植株根系内定植。综上所述,本研究一方面揭示了抗菌肽BbAFP1的蛋白特性、抑菌机理及在球孢白僵菌中产生的生物学功能,丰富了对抗菌肽的认识;另一方面为植物抗黄萎病工程提供新的基因,为棉花抗黄萎病育种提供新的材料。同时,证实了靶向改良在植物抗病基因工程中的可行性,为今后高效抗性基因的设计提供新的策略。