前言 在胚胎发育早期，女性体细胞的两条X染色体中，随机地有一条发生失活，因此正常女性组织的X染色体失活方式为随机性。理论上肿瘤是单个恶变细胞的克隆性增殖而形成，其X染色体失活方式应为非随机性。X染色体失活方式分析(简称X失活分析)是检测人类肿瘤克隆状态的最佳手段。人类雄激素受体基因(HUMARA)分析是目前分析X失活最常用的方法。本研究利用HUMARA分析检测宫颈癌及宫颈上皮内瘤变(CIN)的克隆状态，以期为研究宫颈癌及CIN提供一种新的分子生物学手段。 材料与方法 一、标本与来源 采集2001年7月～2003年1月于中国医科大学第二临床学院及辽宁省肿瘤医院妇科门诊宫颈活检及住院手术病例的新鲜宫颈组织。其中实验组为宫颈浸润癌26例(Ⅰ期9例，Ⅱ期10例，Ⅲ期7例)；CIN31例(CINⅠ级12例，CINⅡ级10例，CINⅢ级9例)；对照组为正常宫颈33例。标本离体后，立即置-70℃冻存待测，所有病例均经病理学诊断核实。 二、实验方法 1．常规酚-氯仿-异戊醇方法提取组织DNA。 2．HhaI酶消化：取2只微量离心管，每管各加入10μl DNA溶液，实验管加入10U／μl的HhaI酶2μl，10×M Buffer 4μl，蒸馏水4μl，制成20μl反应体系；对照管加入10×M Buffer 4μl，蒸馏水6μl，制成20μl模拟反应体系。37℃水浴箱过夜孵育后，70℃加热20分钟以终止反应。 3．PCR扩增：PCR弓物为 5”－TCC AGA ATC TGT TCC AGAGCG TGC—3”和 5”一 GCT GTG AAG G’IT GCT Gh CCT CAT—3；扩增片段长度为255－315hp。25gi反应体系中含模板 DNA sgl，0．lug／PI弓物各 0．2…，2．SInM dNTPZ…，SU／… Taq酶0．2…，10 x Buffer 2．5…，dd·H。O 14．9…。扩增参数：94℃ 3 dn预变性，94t 45 s变性，60t Indn退火，72℃二 dn复性，40个循环后，72℃ 7min延伸。 4．6％变性聚丙烯酸胺凝胶200V电泳4－5 h，凝胶通过银染成像。 5．结果判定：组织DNA在未被酶切的状态下做PCR，产生两条带者为杂合子，对克隆状态分析可提供信息；只产生一条带者为纯合子，对克隆状态分析不能提供信息。杂合子病例的组织DNA被酶切后做利R，若产生两条带，且其信号强度比值＞O．3，则判定为多克隆状态；若只产生一条带，或两条带的信号强度比值SO．3，则判定为单克隆状态［’］。 6．统计学处理：采用 SPSS．0软件进行统计学处理。各组间比较采用 X‘检验或 Fishers确切概率法。 结 果 1．HUMARA的杂合率为88．9％。 2．gi．7％的宫颈癌38．5％的 CIN及 10％的正常宫颈呈单克隆状态，各组间比较人＜o．05，差异有显著性。 3．I、11、Ill期宫颈癌的单克隆率分别为 85．7％J0％及1＊阮，各组间比较，P＞o．05，差异无显著性。 4．CIN、11J级的单克隆率分别为 20％37．5％及 62．5％，呈逐级上升趋势，但各组间比较，P＞o．％，差异无显著性。 ·2· 讨 论 一、克隆状态分析与HUMARA分析 在胚胎发育早期，女性体细胞的两条X染色体中，随机地有一条发生失活，因此正常女性组织的X染色体失活方式为随机性。理论上肿瘤是单个恶变细胞的克隆性增殖而形成，其X染色体失活方式应为非随机性。X失活分析是评价人类肿瘤克隆状态的最佳手段。 HUMARA分析目前是大多数学者分析X失活最常用的方法。HUMARA定位于Xcen－ql3，其第1个外显子的编码区含有高度多态性的 CAG重复序列，编码门一31个甘氨酸残基，在这一多态性短串联重复瞩TR）上游100碱基对左右处，有甲基化敏感性限制性核酸内切酶Hpa 11和 Hha位点，该位点处于甲基化状态时，X染色体是失活的，因此可以通过分析HUMAM的甲基化状态来推测X染色体失活方式，从而判断组织的克隆状态。本研究中HUMARA的杂合率为 88．9％。HUMARA片段的高杂合率使得可以对绝大多数病例通过HUMARA分析检测其克隆状态。 二、宫颈癌的克隆状态及其意义 本研究中，宫颈癌组的单克隆率为gi．7％，明显高于CIN组及正常宫颈组，提示宫颈浸润癌是癌细胞克隆性增殖的结果。HUMARA分析作为目前检测克隆状态的最佳方法，可能成为宫颈癌诊断和鉴别诊断的又一辅助手段。各期宫颈癌的单克隆率比较无统计学差异，提示宫颈癌的癌细胞克隆性增殖先于其浸润性生长而发生。 三人IN的克隆状态及其意义 本研究中，CIN组的单克隆率为38．5％，高于正常宫颈组，提示一部分CIN已具备了细胞异常增殖的能力。但大多数CIN仍 ·3·呈多克隆状态，提示大多数CIN中的异型细胞可能来源于不同的祖先细胞，这符合CIN多中心性的特点。CIN＊＊ 级的单克隆率分别为20％、37．5％及62．5％，有逐级增高趋势，推测可能单克隆状态的CIN异型细胞的异常增殖能力更强，发展为浸润癌的可能性更高；而多克隆状态的CIN，其细